电渗析技术在脱氧核糖核酸在线富集芯片中的应用研究.pdfVIP

第 41卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究报告 第2期 2013年 2月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 242—246 DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．20565 电渗析技术在脱氧核糖核酸在线富集芯片中的应用 黄华斌 庄峙厦 胡 佳 杨朝勇 王小如 (厦门华厦职业学院检验与科学技术系，厦门361024) (厦门大学化学化工学院，厦门361005) 摘 要 基于电渗析技术，制作了一种 “三明治”式的膜分离微流控芯片，用于脱氧核糖核酸(DNA)的无损伤 在线富集。以花菁类染料为荧光指示剂，实现 DNA在此芯片中的在线富集观测；分别以A-DNA和A-DNA． 血红蛋白混合体系为模型化合物，探究其在此芯片中的富集特性 ；对浓缩液进行凝胶电泳实验，以考察 DNA 是否变性，并进行聚合酶链反应 ，以证明本芯片回收的DNA可供进一步的生物分析。结果表明：以花菁类染 料为荧光指示剂，本芯片成功实现DNA的在线富集观测 ；本芯片能够无损伤捕获并浓缩单一体系和简单混 合体系中的DNA分子，DNA的富集倍数近50倍 ，回收率约30％，浓缩液可用于进一步的生物分析。 关键词 电渗析 ；脱氧核糖核酸；富集 ；微流控芯片 1 引 言 目前，针对微流控芯片分析系统中的样品预处理方法和技术的研究已成为分析化学的研究热点之 ll，2J 一 。 与宏观体系纯化不同的是，在微流控芯片系统中，由于微体系的缩微化，大大减小了样品及试剂 的用量，缩短了纯化浓缩所需要时间，提高了实验效率。已经有多种相关的方法和技术的报道 ，如 基于电驱动 的场放大堆积、等速电泳、等电聚焦技术；以及基于固液双相相互作用的过滤、膜分离、固 相萃取等。固液双相分离富集是一种既可实现待测物的浓缩富集又能够去除杂质组分干扰的样品预处 理技术，而且它 比较容易与微流控芯片系统结合实现芯片上操作[1。膜分离技术在微流控芯片系统中主 要用于生物样品中小分子与大分子组分之间的分离富集。Khandurina “在利用电泳对试样 中脱氧核糖 核酸(DNA)组分进行分析之前，在试样 口与侧通道之间加装了硅酸钠多孔膜 。该膜允许溶剂和小分子 通过，DNA则被阻挡、聚集，而导致浓度不断提高。该膜的引入使DNA的富集倍数提高了两个数量级。 本研究在原有工作的基础上8[]，集成膜分离与电驱动技术至微流控芯片上，构建可用于DNA分子 纯化浓缩的预处理芯片；此芯片基于阳离子交换膜对DNA 的截留，以恒流泵为液流驱动力，有效设计并利 用流路死体积，在芯片上构建 “三明治”式的DNA无损伤捕获浓缩装置，并实现荧光在线富集监测。 2 实验部分 2．1 仪器与试剂 微注射泵(HARVARDPHB2000INFUSION)，HL-2恒流泵(上海沪西分析仪器厂)；稳压直流电源 (上海力友电气)；PowerPacBasic凝胶电泳仪(BIO．RAD)；ND．1000全波长紫J,b／可见光扫描分光光度 计(Thermo公司)；凝胶成像系统(美国Kadak公司)；PCR仪 (BIO-RAD)；Spirit激光仪；热压键合机 (JVC一1000)；荧光显微镜 (Nikon公司)；铂金电极，Nafionl135阳离子交换膜 (DuPont)。聚甲基丙烯 酸 甲酯(PMMA，2ITI1TI，深圳 日昌有机玻璃化工有限公司)。 A—DNA(0．3mgDNA／mL，MBI)，TaqDNA聚合酶 (Promega)，琼脂糖 (LP0028A，英国Oxoid公 司)；脱氧核糖核酸(dNTP)(Promega)，溴化乙锭(Sangon生物公司)；其它试剂均为分析纯，超纯水由 Milli—Q制得 (182MQcm)；50bpLadder(Tiangen公司)。 阴极缓冲液：11己缓冲液 (10mmolL／Tris-HC1，1mmol／LEDTA-2Na，pH8．0)；阳极缓冲液 (1mmol／L KH2PO4+35mm