青蒿二烯功能模块与酵母底盘的适配性.pdfVIP

Vo1．34 高 等 学校 化 学 学报 No．12 2013年 l2月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVElqlSITIES 2765～2771 doi：10．7503／cjc 青蒿二烯功能模块与酵母底盘的适配性 贾云婧，赵 鹃，丁明珠，元英进 (系统生物工程教育部重点实验室 ，天津大学化工学院制药工程系，天津 300072) 摘要 设计构建人工酿酒酵母细胞合成青蒿二烯的关键是使外源功能模块与底盘细胞适配，本文通过对外 源功能模块中的载体、蛋白表达和启动子进行优化 ，以提高功能模块与底盘细胞的适配性．使用着丝粒载体 和附加型载体构建了2种青蒿二烯功能模块，在过表达甲羟戊酸(MEV)途径中关键基因(截短的3一羟基一3- 甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMGR及法尼基焦磷酸合酶基因ERG20)的2种酵母底盘中进行适配，得到 适配性较好的人工合成细胞 ，其产量为 11．2mg／L；将青蒿二烯合酶基因(ADS)与ERG20进行融合构建融合 蛋白功能模块，在选定底盘中适配性进一步提高，青蒿二烯的产量提升至 17．5mg／L；采用不同强度的启动 子(TDH3p，TEFlp和PGKlp)对融合蛋白功能模块进行调控，最终得到功能模块与底盘问适配关系更好的人 工合成细胞，其产量提升到71．8mg／L． 关键词 青蒿二烯；酵母底盘；融合蛋 白；功能模块；适配 中图分类号 0629；Q599 文献标志码 A 近年来，利用合成生物学技术在微生物中异源生产植物源萜类物质及其它天然化合物的研究备受 关注…，这种方法克服了植物提取及化学全合成的环境不友好、产率低和过程复杂等不足．在萜类物 质的异源生产中，研究者通过对前体物质积累、外源基因转录及表达水平等影响因素进行优化以提升 产量 侧．在此过程中，外源功能模块与底盘细胞的适配性直接决定了人工合成细胞中代谢流的通畅 程度和前体物质的供给水平，对 目标物质的产量有重要影响． 目前，在酿酒酵母中进行萜类物质异源生产的研究大多集中在对酿酒酵母内的甲羟戊酸(MEV)途 径进行改造上，如过表达MEV途径 中截短的3．羟基一3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(tHMGR)、法尼 基焦磷酸合酶基因(ERG20)和转录因子(upc2一)卜 以提高法尼基焦磷酸(FPP)的积累；敲除或者抑 制角鲨烯合酶基因(ERG9)的表达 以抑制竞争路径鲨烯的合成 。。等．作为抗疟疾药物青蒿素的关键 前体，青蒿二烯的微生物异源合成受到广泛关注．Keasling等 娟通过改造酿酒酵母底盘细胞、提高青 蒿二烯功能模块的表达水平及优化发酵条件等一系列措施，获得了青蒿二烯产量超过40 L的酵母 人工细胞．孔建强等…，通过改造酿酒酵母底盘细胞及对青蒿二烯合酶基因(ADS)进行突变等方法， 获得了最高产量为 123．2mg／L的酿酒酵母工程菌． 尽管青蒿二烯的异源合成已经达到了较高水平，但提高外源模块与底盘细胞的适配性仍可为进一 步提高产量提供可能．在底盘细胞选择方面，不同遗传背景的酵母底盘细胞在萜类物质的异源合成中 的表现有较大差异 ，因此选择合适的底盘细胞对外源模块的表达有重要意义．在外源模块的优化方 面，外源模块的表达水平与载体类型、蛋 白表达方式和水平及启动子强度等密切相关．首先，表达载 体在底盘细胞中的稳定性及拷贝数直接关系到外源功能模块中蛋白质的表达水平 ¨，不同载体所构 建的功能模块与底盘的适配性对 目标物质的产量有很大影响．其次，在选定的底盘细胞中，外源模块 可能无法很快适应内源的复杂环境，导致代谢流不通畅、目标物质的合成受到限制．这种情况可能是 由中间产物的扩散、降解或者流人其它竞争途径等原因所致 ¨zo_．为解决此问题 ，利用蛋白的邻近效 应将代谢流更多地引入 目标途径的方法备受关注 J 卜 ，其中最简单易行的手段就是蛋白融合技术 — — 将催化两个相邻反应的酶通过连接肽连接在一起形成一个蛋白团，缩短两个酶的空间距离．目 收稿 日期：2013-04—15． 基金项 目：国家 “八六三”计划项 目(批准号：2012AA02A701)资助．