免疫学检测技术的基本原理免疫学演示课件.pptVIP

湖北理工学院精品课程;第二十二章 免疫学检测技术的基本原理;第一节 抗原或抗体的体外检测;（2）试管法 为一种定量试验，用以检测血清抗体含量。以协助疾病的诊断，如肥大反应、外斐反应等 。 将待检血清用生理盐水作倍比稀释，然后加入等量抗原，置37℃水浴数小时观察。视不同凝集程度记录为++++(100％凝集)、+++(75％凝集)、++(50％凝集)、+(25％凝集)和-(不凝集)。以其++以上的血清最大稀释度为该血清的凝集价(或称滴度)。 试验时必须设置阳性血清、阴性血清和生理盐水等对照。;2.间接凝集试验(indirect agglutination)将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒状载体表面，与相应抗体作用，在电解质存在条件下，出现的特异性的凝集反应称为间接凝集反应。用来检测待检血清中细菌、病毒、螺旋体、寄生虫抗体及自身抗体（抗核抗体、类风湿因子等）。 优点 敏感性高，比直接凝集反应敏感2-8倍。 常用载体 用红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭等颗粒作为载体，当载体吸附了可溶性抗原后即称为致敏颗粒。;间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition test)：将已知Ab 先与被检的可溶性Ag混合，隔一定的时间后再加入致敏颗粒，如果已知抗体与被测抗原结合，不再出现凝集现象者称为间接凝集抑制试验。常用与妊娠诊断，即用乳胶间接凝集抑制实验检测早期妊娠妇女尿中的绒毛膜促性腺激素。 左侧对照实验：出现均匀的凝集颗粒。妊娠诊断试验阴性：出现凝集现象，即凝集未被抑制，说明待检尿液中无HCG。妊娠诊断试验阳性：不出现凝集，即凝集被抑制，说明待检尿液中有HCG。 凝集（试验阴性）不凝集（试验阳性）;反向间接凝集反应：是将已知抗体吸附到载体颗粒表面，以检测相应可溶性抗原的凝集反应。如检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）及甲种胎儿蛋白（AFP）协助诊断乙型肝炎和原发性肝癌。 3. 协同凝集试验(COAG) 葡萄球菌A蛋白(SPA) 能与多种动物IgG分子的Fc片结合，结合后保持其抗体活性，当与相应的抗原结合时，就可产生凝集反应。本法广泛应用于多种细菌和某些病毒的快速诊断。;（二）沉淀试验 可溶性抗原与相应的抗体结合，在一定条件下，形成肉眼可见的白色沉淀物称为沉淀反应(precipitation)。 参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉淀素。抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等，抗原分子较小，如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等。 1.环状沉淀试验 在内径为2-3mm的小试管底部先加入已知抗血清，然后沿试管壁缓缓加入已适当稀释的待测抗原于血清层上，使之成为分界清晰的两层。数分钟后，两层液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。用于法医的血迹鉴定、昆虫吸血性测定、炭疽病的诊断等。 ;2.琼脂扩散试验 琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满水分，1％琼脂凝胶的孔径约为85nm，各种抗原抗体在琼脂凝胶中自由扩散。 用琼脂制成固体的凝胶，使抗原抗体在琼脂凝胶中扩散，当二者在比例适当处相遇形成肉眼可见的沉淀物，即发生沉淀反应，形成肉眼可见的沉淀带，称为琼脂扩散。;双向双扩散：即用1％琼脂浇成厚2-3mm的凝胶板，在其上打圆孔，是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性 、组成和两种抗原相关性分析的检测。 用8% Nacl溶液制1%琼脂糖平板，打孔（孔径6 mm周边与中心孔距3 mm）。;3.对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis) 原理 抗原在碱性溶液(pH8．2)中带负电荷，在电场中向正极移动，而抗体球蛋白带电荷弱，在琼脂电泳时，由于电渗作用，向相反的负极泳动。将抗体置正极端，抗原置负极端，电泳时抗原抗体相向泳动，在两孔之间形成沉淀带。 琼脂凝胶制备 选用优质琼脂（或琼脂糖），浓度为1％-2％，pH通常用pH8.2-8.6的巴比妥缓冲液，离子强度为0.025-0.075mol／L，并加0.01％硫柳汞作防腐剂。;极-;试验操作 制备琼脂凝胶玻板、打孔，挑去孔内琼脂后，将抗原置负极一侧孔内，抗血清置正极侧孔。加样后电泳30-90min观察结果。 本法优点 a.敏感 较双扩散敏感10-16倍； b.快速 仅需1h左右，大大缩短了沉淀带出现的时间。 c.用途 适用快速诊断检测。如乙型肝炎抗原的快速检测，口蹄疫等的快速确诊。;（三）免疫标记技术：是利用荧光素、酶、放射性同位素等标记抗体或抗原进行抗原抗