高效液相色谱质谱分离分析血浆、尿样中异亮氨酸异构体研究.pdfVIP

首届中国中西部色谱掌术交流会 2006年8月 高效液相色谱一质谱分离分析血浆、尿样中异亮 ’ 氨酸异构体， 赵华，李晶，袁佩，邱宗荫’ (重庆医科大学药学院，重庆400016) 摘要：建立了用邻苯二甲醛和N一乙酰一p芈胱氨酸为柱前手性衍生化试剂，RP-HPLC分离、分析生物样品中异亮氨酸四个异构体，以电喷 和￡-allo-Ile(1．16：t：0．71 mg／L)． 关键词：异亮氨酸异构体，手性分高，藏相色谱一电啧雾电离质谱 氨基酸是生物体内重要的生物活性分子，除甘氨酸外的其它天然氨基酸都有手性中心，都有对 映异构体。过去人们认为高等动物体内只存在z．型氨基酸，而口型氨基酸只在低等动物体内存在。 随着分析技术的不断提高和分析方法的发展，近20年来，从各种不同物种的生物体及哺乳动物体内 发现了越来越多的口型氨基酸以游离氨基酸、肽和蛋白质的形式存在，这些D-型氨基酸的在动物体 内的分布、来源、生理作用及其与疾病的关系倍受关注【1。3】。目前被研究最多的是D-丝氨酸和D-天 门冬氨酸，研究结果表明D丝氨酸主要分布于前脑组织，是谷氨酸受体亚型NMDA 素的分泌有重要的调节作用16。71。此外，被报道存在于哺乳动物体内的口型氨基酸还有D-丙氮酸、 D．亮氨酸、D．脯氨酸、D．苯丙氨酸等。上述被报道的D．型氨基酸是只有一个手性中心的氨基酸，而 苏氨酸和异亮氨酸是有两个手性中心的必需氨基酸，共有4个异构体，它们是否也在哺乳动物体内 同时存在，是人们非常关注的问题。 和伊苏氨酸(／卜Thr)也存在于部分前脑组织和尿液中。我们也尝试用同样的方法分离分析异亮氨 酸的4种异构体，但未成功。本文建立了以邻苯二甲醛和N一乙酰一三一半胱氨酸为手性衍生化试剂， 反相高效液相色谱分离、电喷雾电离质谱(ESI枷S)检测的分析方法，成功地分离了异亮氨酸的4个 异构体，并测定了正常人血浆和尿液中异亮氨酸异构体的含量。 1实验部分 1．1仪器与试剂 LC．MS SAS Fluka， 242 首届中国中西部色谱掌术交流会 2006年8月 色谱纯试剂，水为超纯水。 1．2液相色谱条件 ’．． VP-ODS 色谱柱：Shim-Pack5p．m,150mmx2．Omm 345nm，发 60，V／V)；流速：0．2mL／min柱温：35℃；进样量：5皿。荧光检测波长：激发波长Xex 射波长九em445nm。 。 。 1．3质谱条件 电喷雾离子化源OzsI),负离子检测方式；选择离子监测(SIM)，m／z 391【M-H】’；曲型脱溶剂装 雾化气：N2，流速，1．5L／mira干燥气：N2，流速，2．0L／rain。 1．4样品处理 准确量取正常人血浆或尿液于离心试管中，按1：20的比例加入甲醇溶液，混旋沉淀3min，离 mL，用N2挥干后衍生化。 心(2500r／min)5min。取上清液l 1．5衍生化条件 。 9．8)稀释到5mL，备用。各氨基酸标准液配制为约500 硼酸缓冲液(pH mg／L，等体积混合后加入 进样5止。 2结果与讨论 2．1分离方法的选择 异亮氨酸有两个手性中心，4个异构体，分离非常困难呤1，加上生物样品中亮氨酸的干扰，要达 到