甲基茉莉酮酸对悬浮培养南方红豆杉细胞生理态势的影响研究.pdf

甲基茉莉酮酸对悬浮培养南方 红豆杉细胞生理态势的影响 王艳东 路 明 元英进 (天津大学化工学院制药工程系，天津300072 摘要 利用TIC (氛化三笨slt;.*,2,3,5一triphenyltetrmoliumchloride)浏定方法、蛋白含蚤浏定和 岭活分析技术。研究了甲基茉莉.吐 (methyljasmoaate)作用下悬浮培养南方红豆衫 (Tazuechi-ia ，.。 )细地系列生理生化反应。对其初生代谢研究表明，甲基茉莉阴故产重抑制了细她生长; 蛋白含圣、以L(笨丙孰竣解氛阵)活性、pp0(多盼氧化岭)活性等浏定表明，甲基茉莉NI故可促 进细她由初生代谢向次生代谢转化，有利于细胞次生代谢相关产物的合成。这些翻她生理变化可作为 细地是否进入次生代谢阶段的利别指标。甸胞生理生化研究对甲基茉莉明吐作用机理的揭示有重要忿 义。 类.词 氮化三笨叹久咬 蛋白含贵 甲基茉莉翻改 惫浮培养 南方红豆衫细施 笨丙氛稗挤氛璐 多盼孰化降 自从1977年紫杉醉 (Taxol)特殊的抗痛机理被发现以来[0，由于其较高的药用价值，需求 量一直很大。紫杉醇人工合成产量低且步骤繁杂，自然资源又缺乏，严重限制了在临床上的广 泛应用。因此，多年来，拓宽紫杉醉来源途径，进而提高紫杉醉产量的研究尤为学术界重视。 植物细胞培养生产紫杉醉以其无污染、连续可供等优点，近年来成为研究热点。但研究中 发现，植物细胞培养的难点在于细胞正常生长状态下很难大量合成紫杉醉。所以研究者采用多 种途径提高紫杉醇的产量。其中添加生物或非生物诱导子是首当其冲被选择的方法。甲基茉莉 酮酸 (Methyljesmonate，本文缩写为川)作为一种重要的植物生长调节剂和非生物诱导子，由于 其在紫杉醉生物合成中的显著作用而为研究者瞩目[2.a..]。但众多研究都只集中于其对紫杉醉合 成所产生的效果，却很少单独涉及甲基茉莉酮酸对细胞其它生理指标的影响。本文主要就MJ作 用下，南方红豆杉细胞的初生代谢及除紫杉醇合成以外的其它次生代谢等有关生理生化反应进 行了研究。以期揭示川对红豆杉细胞的生理作用机理，为探索提高紫杉醇合成的新方法打下基 础。 1 材料与方法 1.l 细胞培养 实验用南方红豆杉 (Taxuechinensisvar.mairei)T细胞系由中科院植物所提供。细胞接种于 含50m1改良B5液体培养基的250ml锥形瓶中，25C,110rpm黑暗振荡培养五代以上。选取长势 良好细胞，培养第7天加人MJ，终浓度达100PM;同时设立空白对照。在加人诱导子的第0,3, 4,6和8天取样测定各项指标。 .12 TV:法浏定细胞活力 研究中用TTC法即抓化三苯四氮哇 (2,3,5一triphenyltetmzoliumchloride)还原法测定细胞 活力。具体操作参见文献[51 1.3 可溶性蛋白含童测定 抽滤红豆杉细胞悬浮培养物，收集滤液作为胞外待测液;称取0.300g抽滤后鲜细胞，液氮 冷冻，加人0.0她PVP和少量石英砂，4℃下充分研磨，加人2ml酶粗提液 (含0.2mol/LEDTA, 0.4mmol/LDTT的。.1mol/L磷酸缓冲液)，4oC下离心，取上清液为胞内待测液。考马斯亮蓝法]’{ 测定蛋白质含量。 616 1.4 PAL(笨丙孰酸解孰酶)活性测定 取Iml胞内待测液，加人2mL0.05mo1/L的TTis一H2SO4缓冲液 (pH=8.8),ImL0.02moVL 的苯丙氨酸，混匀，290nm下测吸光度值;将混合后溶液置于3090恒温水浴中反应60min,测量 290nm处吸光度值。以AA/At二0.1/60nun为一个酶活单位。 1.5 胞外酚测定 利用培养墓中酚类物质的积累来检测川 的诱导活性。取8mL培养基滤液，加人l0mL乙酸 乙醋，超声振荡后静止萃取2小时，取5mL乙酸乙醋组分蒸发干燥后，残留物溶于3mL75%的 乙醇中，在280nm下测量其吸光度，以3mL,75%的乙醇为对照l，[。 1.6 胞外PPO(多酚氧化醉)活性测定 比色皿中加人1.5mL0.02mo1“一’的邻苯二酚溶液和1.5mL0.05mo1L’pH=6.0的磷酸缓冲 液。再加人适量胞外待测液，立即于398nm处每隔两分钟读数，以0.2mL0.05motL一pH=6.0 的磷酸缓冲