生物化学与分子生物学（南方医科大学）1-分生大实验须知.pptVIP

课程安排 时间安排 实验题目 实验室条件 实验室要求 报告上交时间 课程安排 1．学生分组（4~5人/小组），选定组长，分配好实验室。GFP实验安排 在第1、2、5、6、7、8实验室进行。 2．开题，学生仔细查询研读资料，自主设计方案，无需提交报告。 3．老师讲解注意事项等之后，学生按分组自主进行实验。 4. 实验分四部分： 质粒提取——PCR——连接、转化——挑菌、提质粒、酶切鉴定 5．全部实验结束后，完成报告。 6．用学术论文的格式来完成实验报告提交（参考学术杂志）。 7．实验报告提交地址：50/rar/ 实验题目：绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 技术路线：1.获取EGFP的基因 2.克隆EGFP基因 （注意：使用T克隆法，不要求表达) 实验设计流程: 实验设计思路 分---PCR分离目的基因 切 接---目的基因与载体相连 转---转入宿主细胞 筛---筛选阳性重组体 实验室提供条件-材料 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5?(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA ?R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验室提供条件-试剂 蓝白T载体（天恩泽） 快速DNA连接试剂盒（碧云天） 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） 质粒提取试剂盒（百泰克或BioEASY） 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验室提供条件-仪器 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱 台式高速离心机，大容量冷冻离心机 PCR仪，紫外分光光度计 水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪 凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 实验室要求 进入实验室前要经过培训。 进出实验室需签名及出入时间，当日实验结束须将物品归位并清洁。 遵守实验室开放时间，防止无故拖延时间，影响进度。 节省实验室一切资源。 试剂盒须分装使用（如T载体、内切酶），避免多次冻融失效。 共用试剂材料须统一配制准备（如感受态细胞，平板培养基板、电泳缓冲液储液等） 节省试剂耗材（如将内切酶做成混合液，避免多次吸取造成浪费）。 实验仪器尽量集中使用或者共用，以减少仪器设备损耗（如高压灭菌锅、制冰机、恒温摇床等）。 报告上交时间 实验报告提交时间：2014-7-5交电子版（每位同学一份）。 电子版文件名：学号后3位-学生姓名-实验名称-年级专业-实验室 电子版文件上传地址： 50/rar/ * * * 绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 EGFP Enhanced?Green?Fluorescent?Protein? 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 分 分离目的基因 切 限制酶切割目的基因与载体 接 连接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体、转化子 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 切 连 转 筛 PCR T连 转 筛 转 表达 切 连 转 筛 转 表达 PCR 鉴定 * *