生物化学与分子生物学（南方医科大学）2-GFP的基因克隆2014春.pptVIP

南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 一、 获取外源基因（PCR） 二、构建重组DNA（T连接） 三、重组DNA的转化 四、重组DNA的筛选（蓝白斑） 五、重组DNA的鉴定（酶切） 实验思路 PCR 转化 筛选 鉴定 T连接 一、获取外源基因 1.碱裂解法提取质粒 2.PCR扩增目的基因GFP （一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含pEGFP-N1质粒的大肠杆菌DH5α? （三）试剂： LB培养基（液体、固体） Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国） 溶液 S1 裂解液 S2 中和液 S3 洗涤液W(去蛋白) 洗脱液 仪 器 材 料 基本原理 1、碱裂解法 基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异； 高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性； 当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉定去除； 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris·Cl(pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 2 mg/mL　溶菌酶 作用： 溶菌酶，水解细菌细胞壁 EDTA,鳌合金属离子使金属酶失活 葡萄糖，维持渗透压 注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块 溶液 SI 0.2 mol/ L NaOH 1% SDS 作用：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的，加入S2，该系统pH值高达12.6，促使染色体DNA与质粒DNA的变性。要温和操作，避免基因组DNA断裂。该步骤可看到菌液逐渐变清亮。 注意：时间勿太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次 溶液 S2 5mol/L 乙酸钾 60 ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 作用：调pH值到中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐有利于变性的大分子染色体DNA,RNA,以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀。该步骤会出现白色絮状沉淀。 注意：复性时间不宜过长 溶液 S3 2、离心层析柱 基本原理 硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA； 去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； 低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱； 菌液 离心13000rpm,1min 弃上清 瞬时离心 彻底弃上清 加250μl 溶液S1 旋涡振荡 悬浮沉淀 加250μl 溶液S2 加350μl 溶液S3 颠倒数次 放置3-5min 离心13000rpm,10min 取上清600μl加到吸附柱中 离心 13000rpm,1min 弃滤液，加入600μl洗涤液W1 13000rpm,1min 离心 （1） （2） （3） （4） （5） （6） （7） （8） （9） 弃滤液，加入600μl洗涤液W2 （10） 离心 13000rpm,1min 放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加40μl洗脱液 离心 13000rpm,1min （13） PCR扩增 / -20℃保存备用 操作步骤 颠倒数次 弃滤液 （12） 空柱离心 13000rpm,2min PCR 转化 筛选 鉴定 T连接 一、获取外源基因（PCR） PCR反应体系 H2O 6?l 质粒DNA（pEGFP-N1） 2?l 引物GFP1 (10?M) 1?l 引物GFP2 (10?M) 1?l Premix Taq 10?l 总体积 20?l 取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)： 如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上 . PCR 转化 筛选 鉴定 T连接 一、获取外源基因（PCR） PCR参数设置 ① 94℃预变性5分钟后开始以下循环 ② 94℃ 30 秒 56℃ 30 秒 30 循环 72℃ 1 分钟 ③ 72℃ 7 分钟 ④ 4 ℃ 保温 实验过程约1小时50分钟 PCR 转化 筛选 鉴定 T连接 一、获取外源基因（PCR） 琼脂糖凝胶电泳 凝胶准备 胶床准备 铺胶 静置 胶床置于电泳槽中 加电泳缓冲液 拔梳子 上样 电泳 取出凝胶 拍照 PCR 转化 筛选 鉴定 T连接 一、获取外源基因（PCR） + - 1 2 3 4 每组上1个样品 1. DL2000 DNA Marker（ 5 ?l ） 2. PCR产物 （ 5 ?l ） 琼脂糖凝胶电泳操作 琼脂糖凝胶的制备 上样：每孔上一个样品，加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀(如预