生物化学与分子生物学（南方医科大学）7.基因工程.pptVIP

* * * * 3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 目 录 4. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 目 录 受体菌条件 安全宿主菌 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA导入受体菌 （五）重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 (插入失活法) 抗药性标记选择 目 录 α 互补的检测 目 录 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 目 录 （一）疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。 三、重组技术与医学的关系 （二）生物制药 重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱 目 录 * * * * * * * * * * * * * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * * * * 重组DNA技术的发展史 年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系 本节主要内容 一、重组DNA技术相关概念 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。 （一） DNA克隆 技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　 DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA)