生物化学与分子生物学（南方医科大学）9.常用分子生物学技术的原理及其应用.pptVIP

基因诊断中常用的分子生物学方法比较 方法 优点与问题 解决方案 核酸分子杂交 结果可靠但操作繁琐 选择合适的探针 PCR 灵敏度、特异性高 设计合适的引物 SSCP 操作简便、检出率不高 选择合适的片段 RFLP 结果可靠但限制较多 选择合适的限制酶 DNA测序 可自动化，但不适宜广泛使用 与PCR配合使用 生物芯片 效率高，成本高，不适宜广泛使用 选择合适的芯片 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段； 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段； 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。 二、PCR技术的主要用途 （一）目的基因的克隆 利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。 （三）DNA和RNA的微量分析 （二）基因突变 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 （一）逆转录PCR技术 三、几种重要的PCR衍生技术 （二）实时PCR技术 实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。 实时PCR技术原理 Q R 3 3 5 5 上游引物 下游引物 荧光标记引物 R Q 3 3 5 5 单链构象多态性分析single-strand conformation polymorphism, SSCP DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。 PCR-SSCP分析原理示意 限制性片段长度多态性分析 restriction fragment length polymorphism, RFLP 由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。 可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。 PCR-RFLP A B C D E F G － ＋ D E F B G C A GAATTC CTTAAG E F B G － ＋ C +D A EcoR Ⅰ限制性内切酶位点的变化 5′ 3′ 正常基因 1.15kb (CCT GAG G) × 5′ 3′ 突变基因 1.35kb (CCT GTG G) 镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析 MstⅡ酶切位点（CCTNAGG） 应用——镰状红细胞贫血限制性内切酶谱分析 目 录 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人 突变携带者 患者 镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析 目 录 核酸序列分析 Nucleic Acid Sequence Analysis 核酸序列分析的基本原理： 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (Sanger法) 一、DNA链末端合成终止法 G A T C 测序反应 电泳 AACGTGGACT AACGTGGAC AACGTGGA AACGTGG AACGTG AACGT AACG AAC AA A 5 3 正极 负极 ddG ddA ddT ddC 链末端合成终止法测定DNA序列的原理 基因文库 Gene Library 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 基因文库(gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 一、基因组DNA文库 基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。 基因组文库和cDNA文库的构建和筛选 cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。 二、cDNA文库 生物芯片技术 Biological Chip Technique 是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固