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ICS11.220 B41 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T XXXXX—2011 山羊痘病毒、羊传染性脓疮病毒的检测 山羊痘病毒、羊传染性脓疮病毒的检测 二重聚合酶链反应法 Detection of goatpox virus and Orf virus by duplex PCR 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 （本稿完成日期：2010年12月7日） 2011 - XX - XX发布 2011 - XX - XX实施 广西壮族自治区质量技术监督局发布 目次 前言 II 1　范围 1 2　术语和定义 1 3　试验材料 2 3.1　用于GTPV和ORFV鉴别检测的特异性引物 2 3.2　试剂 2 3.3　仪器设备及耗材 3 4　操作方法 3 4.1　待检样品的准备 3 4.2　待检样品总DNA抽提 4 4.3　PCR 4 5　PCR 4 5.1　电泳 4 5.2　结果判定 5 附录A（资料性附录）　 6 附录B（规范性附录）　 7 附录C（资料性附录）　 10 附录D（规范性附录）　 11 附录E（规范性附录）　1 12 附录F（规范性附录）　 13 前言 本标准。 本标准由广西壮族自治区水产畜牧局提出。 本标准起草单位：广西。 本标准主要起草人：胡杰陆文俊莫胜兰屈素洁。。 标准名称 范围 本标准规定了应用二重聚合酶链式反应技术检测山羊痘病毒和羊传染性脓疮病毒的材料准备、操作方法及结果判定方法。 本标准适用于山羊痘和羊传染性脓疮的快速鉴别诊断，可对病羊临床组织样品及病毒细胞分离培养物进行检测。 术语定义下列术语和定义适用于本标准。聚合酶链反应polymerase chain reaction , PCR PCR 技术是一种在体外快速扩增特定 DNA的方法。热变性→复性→延伸一个 PCR 循环经过次循环反应目的 DNA扩增。引物primer 与待扩增 DNA 片段两互补的一段寡核苷酸。 特异性引物specific primer 针对特定模板 DNA 片段设计的一段互补寡核苷酸，在 PCR 反应中与模板 DNA 特异性结合。根据的基因组特性，在保守序列设计合成了1对寡核苷酸引物1/GTPV2，在ORFV的基因序列设计合成了1对寡核苷酸引物扩增片段大小分别为和，两对引物的使用浓度均为25 mmol/L。试剂试剂DNA 抽提试剂如下： DNA抽提试剂：平衡酚：氯仿：异戊醇按体积分数分别为25:24:1比例混合； 10％SDS； 20 mg/mL蛋白酶K； 异丙醇； 75％乙醇。 商品信息见附录A。 PCR试剂PCR 试剂电泳试剂其他试剂仪器设备及耗材仪器设备0 μL～1 000 μL、40 μL～200 μL、5 μL～40 μL、0.5 μL～10 μL等多种规格。 一次性耗材离心管：1.5mL和0.5 mL； PCR反应管吸头：0 μL～1 000 μL、40 μL～200 μL、5 μL～40 μL、0.5 μL～10 μL等多种规格。 操作待检样品0 μL待检样品中加入65 μL的10％ SDS和10 μL的20 mg/mL蛋白酶K，振荡混合，37 ℃水浴1 h。加入等体积的DNA抽提试剂，振荡混合，室温作用5 min。于4 ℃ 10 000×g离心10 min。收集上清液，加入等体积的冷异丙醇，颠倒混合均匀，室温作用20 min或者-20 ℃作用过夜。4 ℃ 12 000×g离心10 min，倒去上清液，重新加入1.5 mL75％的冷乙醇。10 000×g离心10 min，倒去乙醇，将离心管倒置于在干净的吸水纸上15 min，风干粘附于管底的总DNA沉淀物。最后加10 μL TE缓冲液至总DNA沉淀中，55 ℃水浴15 min，取3 μL～5 μL总DNA样品进行PCR或者-20 ℃保存备用。 PCR扩增 PCR操作 在冰浴条件下，在PCR反应管中按下列试剂用量分别加入各成份： 25 mmol/L MgCl2: 50 μL，终浓度为2.5 mmol/L； 10倍PCR缓冲液：50 μL，终浓度为1倍； 2.5 mmol/L dNTPs：20 μL，终浓度为0.1 mmol/L； 5 U/μL Taq DNA聚合酶：0.5 μL，终浓度为0.05 U/μL； GTPV上游引物（GTPV1）：0.5 μL，终浓度为0.5 pmol/μL； GTPV下游引物（GTPV2）：0.5 μL，终浓度为0.5 pmol/μL； ORFV上游引物（ORFV1）：0.5 μL，终浓度为0.5 pmol/μL； ORFV下游引物（ORFV2）：0.5 μL，终浓度为0.5 pmol/μL； DNA模板：3 μL； 灭菌双蒸水：补足至总体积为50 μL。 PCR反应程序 加完试剂后瞬时离