药学基因工程.ppt

2、作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 3、分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型） 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 4、命名 HindⅢ 属 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 种 株 序 ※ 5、Ⅱ类酶识别序列特点 GGATCC CCTAGG 回文结构(palindrome) 雾锁山头山锁雾天连水尾水连天 客上天然居，居然天上客 6、切口： 平端切口 粘端切口 5′ -突出粘性末端 3′ -突出粘性末端 大多数酶是错位切割双链DNA，产生5′或3′粘性末端； →断端有单链突出 还有一些沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端。 →断端没有单链突出 Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 粘端切口 5′-突出粘性末端 Bam HⅠ G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 3′-突出粘性末端 GGGCCC CCCGGG GGGCC C C CCGGG + Apa Ⅰ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BstⅠ 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A 同尾酶 两个相同的粘性末端称为配伍未端 基因载体 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体：质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 克隆载体 (cloning vector)： 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。 表达载体 (expression vector) ： 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。 ※ 基因载体分类 ※ 载体的选择标准 能自主复制； 具有遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。 1. 质粒 (plasmid) 特点： 能在宿主 细胞内独立自主 复制；带有某些 遗传信息，会赋予宿主细胞一些 遗传性状。 pBR322质粒特点： 最早被用作载体的质粒； 含有几个单一的限制性酶切位点； 两个用于筛选的抗药基因; 氨苄青霉素耐药基因（ampr）； 四环素耐药基因（terr）; 能独立于宿主染色体自我复制。 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 pUC 18 pUC 19 2686bp α 互 补 1 1 1 （三）接—外源基因与载体连接成重组DNA 1. 粘性末端连接 (1)同一限制酶切位点连接 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 配伍末端的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 2. 平端连接 适用于： 限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 3.