独山子地区乙型肝炎病毒YMDD基因变异检测的临床应用价值探讨.docVIP

精品论文 参考文献 独山子地区乙型肝炎病毒YMDD基因变异检测的临床应用价值探讨 党 迷（新疆独山子石化医院检验科 新疆独山子 833600） 【中图分类号】R512.6+2 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2010)26-0144-02 【摘要】 开展HBV YMDD变异的检测技术并在临床推广应用便于动态观察YMDD变异情况，结合患者HBVDNA有否反跳，对临床提供合理用药，减少患者不必要的经济负担具有重要意义。荧光PCR法用于检测YMDD 基因变异,具有经济实用、自动化程度高、简便快捷的优点。 【关键词】 乙型肝炎 YMDD变异 荧光定量PCR 引言 乙型肝炎病毒(HBV)因其对人类的危害重大而受到重视。拉米夫定能使大多数患者HBVDNA转阴, ALT降低,组织病理上出现不同程度的好转。但近年来发现，随着疗程的延长,部份患者HBVDNA YMDD基序会发生变异,从而产生耐药性甚至病情恶化。本实验采用荧光定量PCR法检测154例慢性乙型肝炎患者的YMDD变异,探讨这种方法在临床上的应用价值。 1 临床资料 1.1全部病例均来自我院2008年6月～2010年6月住院慢性乙型肝炎(CHB) 患者,共154例, 诊断符合1995 年全国病毒性肝炎防治方案制定的CHB诊断标准。其中男103例, 女51例, 平均年龄32岁。所有CHB 患者均接受拉米夫定治疗一年,治疗前血清 HBVDNA在1.0E+03以上,并排除其它肝炎病毒的感染。 1.2方法 1.2.1试剂及原理 试剂采用艾康生物技术公司生产的乙肝YMDD变异试剂盒；达安基因工程公司生产的乙肝DNA试剂盒，在有效期内使用；仪器采用Lightcycler2.0型荧光PCR仪（德国罗氏公司生产）。 1.2.2荧光定量PCR技术方法 取血清50微升，加等量DNA提取液混匀，100℃煮10min，12000rpm离心5min，取上清2微升做PCR反应，取标准参考品4支，浓度依次为1.0E+04；1.0E+05；1.0E+06；1.0E+07，待用。 根据当日检测标本数量和阳性参考品及室内质控的数量，取相应的毛细管，每管加2微升上述标本，盖上试剂反应帽，6000rpm离心30s，取出，小心将毛细管取出，插入Lightcycler反应盘内，将反应盘倒置数秒，安装在仪器内，设置反应程序93℃，2min预变性，然后93℃5s，57℃45s，做40个循环，结果分析设定F1/F2通道，点击Quantification读取结果，调整噪声容限在阴性对照以上，最后仪器自动分析计算出未知标本数值。结果由计算机进行数据处理,分析后以copies/ml 来报告。 1.2.3乙肝YMDD变异技术检测方法 把提取好的HBVDNA模板2mu;l加入18mu;l反应液中,混匀后,加入石英毛细玻璃管,在Light-cycler2.0荧光PCR 仪先进行扩增, 程序如下:37℃2min,94℃2min; 93℃10sec,62℃30sec,共40个循环。结果分析方法基线调整取6—15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照的高点，如果样品的反应混合物B检测阴性，反应混合物C阳性，则可判断该样品为YIDD突变株；如果样品的反应混合物B检测阳性，反应混合物C阴性，则可判断该样品为YVDD突变株；如果样品的反应混合物B和C均阴性，则可判断该样品为野生型株；如果样品的反应混合物B和C均阳性，则可判断该样品为YVDD、YIDD共生株。 1.3统计分析 采用Microsoft Excel表格，进行统计学处理。 2 结果 检测154例患者，7例发生突变，YVDD、YIDD共生株1例，YVDD突变株3例，YIDD突变株3例，突变率为4.5%。 3 讨论 3.1 慢性乙肝病毒性肝炎是危害人类健康的常见病。慢性乙肝的治疗时间长，医疗费用较高，再加上不恰当的滥用药物，更加重了额外的经济负担。对于乙肝患者来说，治疗前后检测YMDD变异情况，以便合理用药，意义重大。 3.2 乙肝毒株发生YMDD变异后，会对拉米夫定产生耐药。因此，在服用拉米夫定后，甚至服用之前，检测YMDD变异对指导临床合理用药,避免造成患者不必要的经济负担、社会资源的浪费以及由此可能产生的严重流行病学危害具有重要意义。 3.3 YMDD变异率的高低与拉米夫定的用药时间、用药前血清HBV DNA水平有一定的关系。目前关于拉米夫定应用后发生HBVDNA YMDD变