谷胱甘肽硫转移酶的分离纯化及酶学特性的研讨.pdf

第48分会场学术沙龙——以科学发展观推动科技的创新 561 谷胱甘肽硫转移酶的分离纯化及酶学特性的研究 蔡俊1 邱雁临1 马辉文2 1．湖北工业大学生物工程学院，武汉，430068 2．武汉大学生命科学院，武汉，430072 摘要谷胱甘肽硫转移酶基图工程茵E、CoIiBL。(DE3)P““表达产生的谷胱甘肽硫转 其纯化倍数为12倍，分离产率为41 32％。酶活最适pH为6．5～7．0，最适温度为50℃，最佳 酶促反应时问为30rain。 关键词酶学谷脆甘肢硫转移酶分离纯化酶学特性 月U置 谷胱甘肽硫转移酶(GsT)是一类具有多种生理功能的同功酶，它不仅能催化生物体内有害的毒性 化合物与谷胱甘肽相结合，并且促使它们以非酶的方式排出体外。谷胱甘肽硫转移酶广泛存在于生物 体内，如哺乳动物、鸟类、植物及微生物等。目前，谷胱甘肽硫转移酶的某些研究工作已较为深入，如巯 基试剂的活化作用，底物特异性、纯化酶的某些性质、氨基酸组成及其一级结构的测定等。本研究是在 对谷胱甘肽硫转移酶基因工程菌E．ColiBb。(DE，)P“”的表达条件进行了研究的基础上，主要采用硫酸 一、材料与方法 (一)材料 (1)培养液自制，酶的活力为387 lp．mol／(ml·h)。 l一氯一2，4一二硝基苯(CDNB)：AR，购自上海试剂一厂。 燥机：I。GJ一10。 (二)方法 1．粗酶的制备 达87％，静置2h．在4C、8000rpm下离心20min，收集沉淀。 2．酶的纯化 562 以科学发展观促进科技创新(中) 清液过SephadexG一25柱(16ram×60cm)，用去离子水洗柱两次后，用50raM pH6．5的Tris—HCI洗 脱，收集酶话高的洗脱部分，将收集部分过SephadexG一100柱(16ramx60cm)，用去离子水洗柱两次 后，用50raM pH6．5的Tris—HCI洗脱，收集酶活高的洗脱部分并在去离子水中透析过夜，冷冻干燥得 酶粉。酶粉溶于10ml蒸馏水中备用。 3．酶学特性的研究 确定酶的最适反应温度、pH值及酶的进程曲线 4．谷胱甘肽硫转移酶(GST)活力测定 20m 取1m110mmollLCDNB，lml rnol／LGSH装入一支试管中，加1ml待测液，加7mlpH6．5磷酸 值△A，按_F式计算酶活。 酶活2而‰。K 式中：AA——样品吸光值与空白吸光值之差； V——酶液体积(m1)； 96——为以CDNB做底物时的摩尔系消光系数△￡(m7M·cm)； 1——为比色皿厚度(cm)； K——稀释倍数。 一个酶活单位是指：在50C pH6．5条件下，每小时每毫升酶液催化底物CDNB与GSH结合产生 1／mml产物就为一个酶活单位。 5．蛋白质的测定凯氏定氮法(见参考文献9。内容略) 二、结果与分析 (一)谷耽甘肤硫转移酶的分离纯化 襄1 谷胱甘肽硫转移酶的分离纯化结槊 ———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————一 纯化方式 蛋白质总量(fng)酶活(units) 相对酶活(umt√瑚晤)收率(％) 纯化倍数 硫酸铵盐析423 11349 2683 5963 s SephadexG一25 306