生化研究技术与方法 -1沉淀法27.ppt

南京农业大学 生命科学学院 南京农业大学 生命科学学院 * * 南京农业大学 生命科学学院 生物化学研究技术与方法 第二章 沉淀法 沉淀法是纯化生物大分子常用的一种经典方法。该法操作简单，成本低廉，一般包括盐析沉淀、有机溶剂沉淀和选择性沉淀等类型。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * 生命科学学院 生物科学51班 * 第二章 沉淀法 基 本 原 理 蛋白沉淀法 1 2 3 核酸沉淀法 第一节 沉淀的基本原理 沉淀法也称溶解度法。 其纯化生物大分子的基本原理是： 根据各种物质结构的差异（如蛋白分子表面的疏水基团和亲水基团之间比例的差异）来改变溶液的某些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），就能致使抽提液中有效成分溶解度的变化。 可通过选择适当的抽提溶剂使欲分离的有效成分最大溶解，而杂质最小溶解；或者相反。从而达到分离的目的。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 第一节 沉淀的基本原理 蛋白沉淀法： 盐析法 有机溶剂沉淀法 蛋白质沉淀法 核酸沉淀法： 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 其它沉淀剂沉淀法：聚乙二醇（PEG），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），LiCl，精胺，钙盐。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 聚乙二醇沉淀法 选择性沉淀法 结晶沉淀法 第二节 蛋白沉淀法 1. 盐析法 原理： 根基蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随着盐浓度的增高而上升（盐溶） 但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。 盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 第二节 蛋白沉淀法 1. 盐析法 盐的选择 一般蛋白沉淀时选用硫酸铵，原因： 溶解度大，对温度不敏感 分级效果好 有稳定蛋白质结构的作用 价格低廉，废液可以肥田 盐析的缺点：样品继续纯化时须脱盐。 硫酸铵的缺点是铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 第二节 蛋白沉淀法 1. 盐析法 硫酸铵盐析 固体法。在大体积粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，当达到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀下来。 饱和溶液法。较固体法温和，但不适用于大体积样品，会导致样品体积大量增加。 透析法。将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的盐溶液中，通过透析作用改变蛋白质溶液中的盐浓度。该法以盐浓度连续变化避免局部盐浓度过高的影响，分级效果好。但受透析袋容积、盐析速度、及硫酸铵耗费大的制约，仅用于精确、样品体积小的试验中。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 硫酸铵盐析 固体法 g = 533(S2-S1)/(100-0.3S2) (20 ℃) g = 541(S2-S1)/(100-0.3S2) (20 ℃) g：1升溶液中需加入固体硫酸铵的克数 S1：表示需要达到的百分饱和度 S2：表示原溶液中的百分饱和度 饱和溶液法 V = V0(S2-S1)/ (S3-S1) V ：表示需要加入的硫酸铵溶液体积（ml） V0 ：表示原来溶剂的体积（ml） S1与S2同上 S3 ：表示需要加入的硫酸溶液的饱和度 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 硫酸铵分级沉淀示例： 各溶解度区段的沉淀效果（尿素酶）： * 南京农业大学 生命科学学院 * 名称 沉淀效果 硫酸铵饱和度/ %（25℃） 0~25 25~35 35~45 45~55 55~65 沉淀物酶活力单位/ U 0 112 6850 3020 27 * 南京农业大学 生命科学学院 * 调整硫酸溶液饱和度计算表 第二节 蛋白沉淀法 1. 盐析法 盐析的影响因子： 蛋白质浓度对盐析的影响：蛋白质浓度过大，盐析时发生共沉现象，分离效果不好；蛋白质浓度太稀，耗盐量过大，蛋白质回收率也低。一般控制样品液蛋白浓度在0.2%-2%为宜。 离子强度和离子类型对盐析的影响：离子强度越大，蛋白质的溶解度越低，越容易产生盐析现象；离子半径小而价数高的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而价数低的离子对盐析影响弱。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 盐析的影响因子： pＨ对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶解度越大；在净电荷为零时，溶解度最低。一般将pＨ值调到蛋白质等电点附近，这样