[化学]生物化学技术实验指导110327.docVIP

生物化学实验指导 温州医学院检验医学院、生命科学学院 2011年3月 目录 第一部分 生物化学常用技术及原理 常用生物材料的处理 生物化学实验中一些基本操作 第二部分 实验记录报告及实验设计简介 实验记录 实验报告 实验设计简介 第三部分 实验 实验一 血清白蛋白的分离与纯化 实验二 蛋白质的醋酸纤维薄膜电泳 实验三 SDS测定蛋白质相对分子质量 实验四 等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点 实验五 双缩脲法测定血清蛋白质量 实验六 考马斯亮兰法测定血清蛋白质 实验七 酵母细胞核酸的提取、鉴定 实验八 淀粉酶的动力学实验 实验九 碱性磷酸酶米氏常数的测定 实验十 乳酸脱氢酶同工酶分离及鉴定 实验十一 葡萄糖耐量试验 实验十二 Folin-吴法测定血糖 第一部分 实验常用技术及原理 一、常用生物材料的处理 在生物化学实验中，无论是分析组织中各种物质的含量，或是探索组织中的物质代谢过程，皆需利用特定的生物样品。由于实验的特殊要求，往往需要将获得的样品预先做适当处理。掌握此种实验样品的正确处理与制备方法做好系列化实验的先决条件。 基础系列化实验中，最常用的人体或动物样品是全血、血清、血浆及无蛋白血滤液。有时也尿液做实验。组织样品则常用肝、肾、胰、胃粘膜或肌肉等组织制成组织糜、组织匀浆、组织切片或组织浸出液等，用于各种生化实验。 关于这些样品的制备方法，扼要介绍如下： 1、血液 全血 无论收集动物或人体血液时，一方面要注意仪器的清洁与干燥，要及时加入适当的抗凝固。一般在血液取出后，迅速盛于含有抗凝剂的试管内，同时轻轻摇动，使血液与抗凝剂充分混合，以免形成凝血小块。取得的全血如不立即进行试验，应储存于冰箱中。 常用的抗凝剂有草酸盐、柠檬酸盐、氟化钠或肝素等，可视实验要求而定。一般情况下，用廉价的草酸盐即可，但在测定血钙时不适用。氟化钠可做为测定血糖时的良好抗凝剂，因其兼有抑制糖酵解的作用，以免血糖分解。但氟化钠也能抑制脲酶，故用脲酶测定尿素时不能用。肝素虽好，但价格较贵，尚不能普通应用。 抗凝剂用量不应过多，以免影响实验结果。通常每毫升加1-2mg草酸盐或5mg酸钠或5-10mg氟化钠，肝素仅需要0.01-0.02mg，最好将抗凝剂制成适当浓度的水溶剂，然后取0.5ml置于准备盛血的试管中，再横放蒸干（肝素不宜超过30℃），则抗凝剂在管壁上形成一层薄膜，使用时较为方便，效果也好。 血浆 上述抗凝的全血在离心机中离心，则血球下沉，上清液即为血浆。如需应用血浆分析，必须严格防止溶血，故要求采取血液时一切用具（注射器、针头、试管等）皆需清洁干燥，取出血液也不能剧烈振摇。 血清 收集的血液不加抗凝剂，在室温下约5-20分钟即自行凝固，通常经3小时，血块收缩而分出血清。为促使血清出，必要时可离心分离，或置37℃水浴中，这样可缩短时间，并取得较多的血清。 制备血清也要防止溶血，一方面仪器要干燥，另一方面，血块收缩后，及早分离出血清，因为放置过久，血块中血球也可能溶血。 无蛋白血滤液 许多系列化分析要避免蛋白质的干扰，往往先将其中蛋白质然后去除，制成无蛋白血滤液。如血液中的非蛋白氮、尿酸、肌酸等测定需先把血液制成无蛋白血滤液后，再进行分析测定。蛋白质剂如钨酸，三氯醋酸或氢氧化锌皆可用于制备无蛋白血滤液，可根据不同的需要而加以选择。 血液样品的保存 血液成分容易发生变动，原则上应尽进行分析。如必须暂保存时，应放入冰箱。全血最不，可做成除蛋白滤液保存。血浆应及时与血细胞分，血清也应与凝块分开，单独保存。 2、尿液 （1）采尿 尿液成分及浓度生理变动较大。按实验目的不同，可用不同的尿液。许多定性实验可用随时采取的一次尿样。清晨第一次尿样，比较稳定，便于比较，也常采用。为定量实验常需采用全日尿样。 全日尿亦即由第一天某时开始到第二天同一时间的24小时尿，具体采法如：在第一天晨6时排尿一次弃去以后的尿液全部收集到加有适当防腐剂的容器中，到晨6时，不论有无尿意，再计尿量多者应另有准备。采尿中间不可有异物混入。采尿完了后，把全部尿液充分混匀，最记总体积及其他必要项目，然后留取一部分供实验用。 （2）防腐 为防止采尿过程中及暂保存中尿液成变化，需要加适当的防腐剂。选用不影响实验目的的防腐剂。常用的有甲苯，全日尿中加2-5ml，它成一薄层盖在尿液表面上，适用于一般测定。另外，也常用冰醋酸（约10ml）、浓盐酸（约10ml）等。 3．组织 根据实验目的不同则选用组织和处理方法亦不同。许多实验中常用肝脏或肌肉，这是因为其量多且含酶类较全，尤其肝脏代谢机能广泛，且其组织易于处理，最常用。组织材料的处理过程中最重要的原则 是勿使待分析物质发生变化或损失。 （1）动物的处理 一般常用兔、鼠、蛙等，可用打击头部使