结核分枝杆菌耐利福平株rpoB基因突变的研究.docVIP

精品论文 参考文献 结核分枝杆菌耐利福平株rpoB基因突变的研究 廖小琴 刘梅（通讯作者） 王建华 张泓 陈玲（通讯作者） （遵义医学院附属医院呼吸二科呼吸医学研究室 贵州遵义 563003） 【摘要】 目的 了解遵义地区结核分枝杆菌耐利福平临床分离株rpoB基因突变特点。方法 采用比例法对肺结核患者痰标本分离的127株结核分枝杆菌进行药物敏感性试验，并对结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因包括耐药决定区81个碱基在内的412bp片段进行PCR扩增及序列测定。结果 127株结核分枝杆菌临床分离株中49株对利福平耐药，78株对利福平敏感。49株耐利福平临床分离株中，31株rpoB基因存在突变（63.3%），突变位点为531、526和516等；511位点CTGrarr;CAG（Leurarr;Pro）为新的突变位点；4株双位点联合突变，其中2例为新的联合突变：GAC516GGC，ATC572CTC和CTG511CAG，CAC526AAC。结论 结核分枝杆菌耐利福平与rpoB基因突变相关，且存在地区差异。 【关键词】结核分枝杆菌 rpoB 利福平 耐药 突变 近年来，由于耐药结核病的广泛流行等原因，结核病呈现死灰复燃趋势。利福平(rifampin，RFP)是目前抗结核一线药物中主要药物。RFP与结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)RNA聚合酶beta;亚基结合,抑制转录而发挥杀菌作用。RNA聚合酶beta;亚基由rpoB基因编码。MTB对RFP耐药主要与rpoB基因的突变有关。目前已发现的耐RFP临床分离株中rpoB基因突变位点超过70个，约96%的RFP突变分布在rpoB基因的利福平耐药决定区(rifampin resistance determing region，RRDR)的81个碱基内，以531、526及516位点突变最常见[1]。本研究旨在了解本地区耐利福平MTB rpoB基因突变特点，为耐药结核病的快速检测奠定基础。 1 材料与方法 1.1MTB临床分离株的来源、培养及药物敏感试验 肺结核患者痰标本来自贵州省遵义医学院附属医院2009年6月至2012年7月期间门诊及住院病人，分离出MTB共127株。结核分枝杆菌H37Rv标准株由贵州省疾病预防控制中心结核病防治所惠赠。MTB培养及药物敏感试验（比例法）按《结核病诊断实验室检验规程》进行。 1.2MTB基因组 DNA的提取及PCR扩增 1.2.1MTB灭活及破壁处理:用接种环刮取适量新鲜菌落,置于含少量生理盐水的无菌离心管中,80℃灭活30min；12000r/min离心5min,弃上清，各加入400ul1times;TE溶液，吹打混匀制成菌悬液,加入50ul溶菌酶溶液,混匀,37℃孵育过夜。 1.2.2DNA提取：采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取DNA,-20℃保存备用。使用前用灭菌超纯水将DNA原液稀释为10ng/ul的工作浓度。 1.2.3rpoB基因的扩增：rpoB引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成,引物上游5prime;-TCGACCACTTCGGCAACCGC-3prime;，下游5prime;-TTGACCCGCGCGTACACCGA-3prime;（412bp）。PCR总体积为25ul,包括:10times;High Fidelity buffer 2.5ul、10mmol/L dNTP Mix 0.5ul、20mmol/L的上、下游引物各0.5ul、ddH2O 19.75ul、High Fidelity Hot Start Pol DNA 聚合酶0.25ul、10ng/ul的MTB DNA模板1ul。反应条件95℃2min，95℃20s,62℃30s,68℃40s,30个循环；68℃40s。PCR产物各取1ul，经2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。 1.3rpoB基因测序与分析 将PCR产物送至上海立菲技术有限公司（原上海英骏公司）进行DNA测序，引物采用rpoB-F。用NCBI BLAST在线将所测得的序列与H37Rv 菌株的rpoB 标准序列（GenBank：NC_000962）进行比对，并分析结果。 2 结果 2.1MTB利福平药物敏感试验 127株MTB中49株对利福平耐药，78株对利福平敏感，耐药率38.6%。 2.2PCR扩增产物与目的片段大小一致 49例MTB菌株rpoB基因的PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，于412 bp大