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分子克隆基础教程
酵母中常用的启动子 组成型启动子: TPI,GPD,TEF,ACT…… 一般是各种中心代谢途径中的酶或细胞骨架的启动子,不需要诱导即可实现高效表达 缺点:无法实现可控表达 诱导型启动子: GAL1,GAL4,GAL10…… 半乳糖诱导 缺点:葡萄糖抑制,半乳糖价格昂贵,无法用于实际生产和大规模的实验 10. 常用软件 Vector NTI Advance 11 序列管理与质粒作图 Primer Premier 5.0 + Oligo 6.71 引物设计与质量评估 Quantity One 凝胶电泳图像处理 Adobe Illustrator CS4 + Adobe Photoshop CS4 电泳图像后处理与示意图 以上软件均须熟练掌握! 11. 常用网址 NCBI 序列查找与比对:/ iHOP 基因名称的含义:/UniPub/iHOP/ KEGG 基因所在的代谢途径:/ ProtocolOnline 分子生物学操作步骤:/ AddGene 质粒百科全书:/ EUROSCARF 酿酒酵母信息收集:http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/ 蛋白质信息: SwissProt http://www.expasy.hcuge.ch/sprot/sprot-top.html ENZYME http://www.expasy.ch/sprot/enzyme.html OMIM /omim/ ProteinDataBank http://www. rcsb. org/ 模体和结构域数据库: Dali http://mercury.ebi.uk/dali/ ProDom http://protein.toulouse.inra.fr/prodom.html PROSITE http://www.expasy.ch/sprot/prosite.html 12. 常用供应商 上海生工、碧云天 各种试剂、试剂盒; 各种试剂盒、分装试剂; Takara、Clontech 各种分子生物学用酶; NEB 高端的内切酶和各种修饰酶 Sigma 相关试剂盒和酶 Promega、Invitrogen、Strategene、QIAGEN、MBI/Fermentus 各种质粒、酶和试剂盒 谢谢! 分子克隆基础教程An Essential Course of Molecular Cloning 江南大学 生物系统与生物加工研究室 * 概述 PCR 凝胶电泳 质粒提取 基因组提取 怎样把一个基因连接到质粒上? 怎样把几个片段连接到一起? 基因敲除 过量表达 质粒的结构 常用软件 常用网址 常用供应商 1. PCR 酶的选择: 普通的DNA聚合酶:Taq末端有A尾,可以直接用于TA克隆,连接到T载体上; 高保真的DNA聚合酶:Pfu (Pyrobest)末端无A尾,无法直接连接至T载体上。 反应条件的选择: Mg2+: 过低反应无法进行,过高易产生错配; Mn2+: 使错配率增加,用于易错PCR,进行定向进化。 特殊的PCR: 融合PCR(与SOE-PCR原理一致): 见文献: Shevchuk, N. A., A. V. Bryksin, et al. (2004). Construction of long DNA molecules using long PCR-based fusion of several fragments simultaneously. Nucleic Acids Res 32(2): 12. Szewczyk, E., T. Nayak, et al. (2006). Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat. Protoc. 1(6): 3111-3120. 2. 巢式PCR 目前已经较少用到。 3. 易错PCR (Error-Prone PCR) 用于随机突变。通过控制Mg2+和Mn2+的浓度实现。 2. 凝胶电泳 电泳基质主要分为琼脂糖和聚丙烯酰胺两类 平常我们主要用琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖浓度的选择一般按下表,1%的琼脂糖最为常用,可以分离分子生物学操作中常见的片段大小。 琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA大小/kb 60~5 20~1 10~0.8 7~0.5 6~0.4 4~0.2 3~0.1 琼脂糖浓度与DNA分离范围 Marker的大小应根据预计片段的大小进行选择 质粒或其它环状DNA的大小不能根据Marker进行判断! 琼脂糖胶和PAGE胶制备方法 一、琼脂糖凝胶的特点天然琼脂(Agar)是一种多聚糖,主
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