海湾扇贝g型溶菌酶基因的重组表达及其产物活性分析研究.pdfVIP

藕建羹亿’ 第三届海洋生物高技术论坛 200s．08．19-23 海湾扇贝g型溶菌酶基因的重组表达及其产物活性分析+ 赵建民’宋林生‘李成华邹慧斌 中国科学院海洋研究所实验海洋生物学开放实验室，青岛266071 摘要：溶菌酶是自然界中广泛存在的具有抗菌效应的分子，它在无脊椎动物的免疫反应中发挥 着重要的作用。通过RT—PCR技术，从海湾扇贝中扩增出g型溶菌酶基因的成熟肽编码区， Sac I酶切线性化后，采用PEG方法转化毕赤酵母宿主茵GSl15获得阳性克隆。阳性克隆经 G418筛选获得多拷贝重组子，0．5％甲醇诱导表达发现重组海湾扇贝g型溶菌酶在c【因子的 引导下，分泌到培养基中，表达产物在分子量20K处有一条特异性的条带。抑菌试验显示重 组产物具有广谱抗菌活性，其对革兰氏阳性菌的抑菌效果强于革兰氏阴性菌，本实验结果为 进一步研究海湾扇贝g型溶菌酶的功能和活性，为研制新型的具有抗微生物活性的药物和在 水产养殖业上作为替代抗菌素的新型病害预防治疗制剂奠定了基础。 关键词：海湾扇贝，g型溶菌酶，重组表达，抗菌活性 3．2．】．】7)又称粘肽N一乙酰基胞肇酰水解酶，能催化细菌细胞肇中 溶菌酶(Lysozyme，EC 肽聚糖N．乙酰葡萄糖胺和N．乙酰胞肇酸之问f向B．1，4糖甘键的水解，导敛细菌细胞肇破裂、 内锌物逸出J叮使绌菌死亡，其在自然界中广泛存在，具有广谱的抗菌效心【I2’3】。此外溶菌酶 还可诱导调节机体其他免疫|大l子的合成与分泌、防同其它免疫I大l子进行免疫防御，对J二缺少 特异性免疫的兀脊椎动物来说，溶菌酶是其免疫体系中非常重要的一个环节【4，5】。 扇贝养殖是我幽传统的海水养殖产业，但从1994=frI以来，养殖贝类开始出现大规模死亡 现象，经济损失十分惨重。养殖贝类病害的不断爆发及病因的多样性迫切要求从扇贝本身的 免疫防御l大I子入手，研究其抗病机制和制定新f向疾病防治措施，其中，溶菌酶作为具有杀菌 作用和免疫调理功能的重要效应分子备受关注。自1999年第一种贝类溶菌酶基闪序列报道 斤，分别从冰岛扇贝【6】、贻贝【7】和美洲牡蛎[8】等贝类中扶得了溶菌酶基因的全长序列，但到 目前为If：，所有在贝类中发现的溶菌酶均为i裂溶菌酶。 irradians)隶属，j：软体动物门，瓣鳃纲，珍珠贝目，是我幽从美国引 海湾扇贝fArgopecten 进的一个重要的海水养殖品种，其缺乏特异性免疫系统，依赖。：I：原始的非特异性免疫系统。 本研究室通过EST策略结合锚定PCR技术从海湾扇贝中克隆到一种g型溶菌酶基圳的全长 cDNA)芋Y0，它是迄今为II：在儿脊椎动物中茸次报道的g型溶菌酶基斟，它含有g型溶菌酶高 度保守的3个活性LfJ心：Glu82，Asp97，Aspl08【uJ。为了进一步研究该海湾扇贝g型溶菌酶的结 科学綦会资助项11。 。通讯作者。Email：!§bs蚀g鱼堕!§：g垡iQ：堑：鲍 440 翟毽ln‘ 第三届海洋生物高技术论坛 2005．08．19．23 构和功能，选择兼备高表达量及翻译后修饰的毕赤酵母表达系统进行了体外重组表达，该基 冈的重组表达成功对进一步认识海湾扇贝的免疫防御机制，为研制新型的具有抗微生物活性 的药物和在水产养殖业上作为替代的抗菌素的新型病害预防治疗制剂奠定了基础。 1材料与方法 1．1实验菌株和质粒 海湾扇贝cDNA文库和抗菌活性供试菌由本研究室保存；Pichiapastoris表达载体 pPIC9K、宿主菌GSll5、E．coliTopl0为Invitrogen公司产品。 1．2培养基和其它试剂 牛赤酵母的培养及培养基的配制参照Invitrogen公司毕赤酵母表达系统使用手册，YPD 培养基用于酵母菌的培养，MD培养基用于酵母转化子的筛选，BMGY和BMMY培养基用 Marker购自TaKaRa公 J二酵母菌转化子的诱导表达。T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNA 司，蛋白质Marker为MBI公司产品，其余常用试剂为上海生工产分析纯试剂。 1。3克隆载体pMDl8-T-Lsz的构建