肝硬化患者外周血单核细胞中DcR3基因表达的意义.docVIP

精品论文 参考文献 肝硬化患者外周血单核细胞中DcR3基因表达的意义 杨光松原市长岭县人民医院(吉林 长岭131500)) 【摘　要】　目的　探讨外周血单核细胞( PBMC) 中DcR3 基因表达水平与肝硬化的关系。方法　64 名肝硬化患者和60 名健康对照者各取5 ml 静脉血，肝素抗凝，密度梯度离心法分离PBMC ，TRIZOL法提取PBMC 总RNA ，用半定量RT-PCR 法检测PBMC 中DcR3 基因的相对表达水平，并用t 检验进行比较。结果　　肝硬化患者组PBMC 中DcR3 基因的相对表达水平为0.398 plusmn;0.034 ，与正常对照组(0.246 plusmn;0.023) 相比有明显差异( P lt; 0.05) 。结论　肝硬化患者PBMC 中DcR3 基因的表达水平增高。 【关键词】　　DcR3 基因表达 肝硬化 外周血单核细胞 ［中图分类号］R575.2 ［文献标识码］A ［文章编号］1810－5734(2010)11-0087-02 肝硬化的发病机制尚未完全阐明，但大量的资料表明肝硬化与自身免疫有关。而Fas/ FasL 系统介导的凋亡功能紊乱在某些自身免疫病的发病中起重要的作用［１］。新近发现一个可溶性受体蛋白——诱惑受体3 (decoyreceptor 3) 能竞争性地与FasL 结合，从而阻断FasL 诱导的凋亡，因此可能使Fas/ FasL 功能失调，在自身免疫病及肝硬化发病中起一定的作用［２］。本实验采用RT-PCR 法检测DcR3 基因在肝硬化患者及健康人外周血单核细胞(PBMC) 中的表达，以探讨其表达与肝硬化的关系。 1 材料与方法 1．1　主要试剂及仪器 ： 十二烷基肌氨酸钠、DEPC购自Sigma公司，Oligo d ( T) 、AMV逆转录酶、RNA 酶抑制剂、Taq DNA 聚合酶、细胞分离液等购自Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成并纯化。德国高速低温离心机HERMLEZ383，凝胶电泳成像分析系统TannonGIS1000 ( Tannon有限公司，上海) ，深低温冰箱Formo (USA)，恒温水浴箱DK28D (上海医用恒温设备厂) , PCR 仪FeroTec (杭州PCR 仪有限公司) 。 1.2 　研究对象　：肝硬化 患者64 例,男38 例，女26 例，年龄35～70岁，平均52 岁。全部病人均经肝CT、及肝功能功能检查确诊，且未经治疗。健康对照组60 例，男35例，女24 例，年龄20～65 岁，平均46 岁。 1.3 实验方法 1．3．1 　PBMC 分离　　：研究对象各取静脉血5 ml,肝素抗凝;加入含5 ml淋巴细胞分液的离心管中，离心2 000 r/min, 20 min，可见血浆与分离液的界面上有一白膜层，此即所需的PBMC。吸出细胞至另一试管用生理盐水洗3 遍,离心2 000 r/min， 5 min，弃上清。 1．3．2 RNA 的提取及RT-PCR：　在上述PBMC标本中加入变性裂解液Trizol 1 ml吹打使细胞充分溶解,置室温5 min后加入氯仿200mu;l，剧烈震荡15 s，室温5 min， 4 ℃12 000 rmin离心15 min，取上清加入等体积的异丙醇,混匀后- 20℃ 1 h，4℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，加入75%乙醇1 ml， 4℃7 500 r/min离心5 min,吸去乙醇自然干燥10 ～20min,溶于10mu;lDEPC水中。此即人外周血总RNA。在上步得到的10mu;l模板RNA中，加入1mu;lDEPC水， 1mu;l引物Oligo d ( T)，稍离心，100℃沸水1 min;加入2mu;l dNTP， 4mu;l 5 times;buffer，2mu;lAMV逆转录酶，稍离心， 42℃水浴90 min；沸水3 min，灭活AMV，得到总cDNA。　 聚合酶链反应PCR 扩增DcR3基因(214 bp)和beta;-actin基因(570 bp) 。引物序列：DcR3基因引物正义链为5prime;- TCAATGGCCAGGCTCTTC-3prime;, 反义链为5prime;- GCCTCTTGATGGAGATGTCC-3prime;;beta;-actin 基因引物正义链为5prime;-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3prime;,反义链为5prime;-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATTGGAGGG-3prim