肠道病毒71型检测与VP1基因特征分析.docVIP

精品论文 参考文献 肠道病毒71型检测与VP1基因特征分析 许建平 钟国权（河源市源城区人民医院 517000） 【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）7-0224-01 【摘要】目的 分析肠道病毒71型2011年本地流行株VP1基因特征学特征。方法 收集2011年本地手足口病患者临床标本332份，进行EV71荧光定量RT-PCR鉴定，采用RT-PCR对15株分离到的EV71进行VP1编码区基因扩增，并对扩增产物进行核苷酸序列测序和分析。根据VP1测序结果与国内外报道的各基因型和基因亚型EV71 VP1序列进行同源性和亲缘进化分析。结果 165份标本鉴定为EV71，分离株的VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别是97.5%～99.9%和99.4%～100%。与C4a亚型的核苷酸和氨基酸最高。亲缘进化树显示，本地株全部属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论 本地区分离的EV71与近几年国内其他地区EV71分离株亲缘关系很近，有共同进化的趋势，属于C4基因亚型的C4a进化分支，并存在多个传播链。 【关键词】肠道病毒71型 基因特征 遗传进化 手足口病（hand，foot and mouth disease， HFMD）是由多种肠道病毒引起的，严重威胁儿童健康的全球性传染病。临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹，伴有发热、咽痛、倦怠乏力等症状，个别重症患儿病情进展快，可发生死亡。为全面了解本地区手足口病病原学分布的情况，对本市446份手足口病临床诊断标本进行检测，现将结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 标本来源 2009～2010年各医院送检的HFMD临床诊断标本共332份，其中粪便、咽拭子、肛拭子、脑脊液、气管洗液标本各201、72、43、12、4份。 1.2 核酸提取和荧光定量RT-PCR检测 采用QIAGEN Reansy Mini Kit试剂盒，操作步骤参照Rneasy Mini kit Handbook。上海之江生物科技有限公司生产的肠道病毒71型荧光检测试剂盒和柯萨奇病毒A组16型荧光检测试剂盒。 1.3 EV71 VP1基因扩增 将检测为EV71阳性的病毒核酸进行全长VP1编码区的核苷酸序列测定和分析。上游引物：VP1-F：5rsquo;-GCAGCCCAGAAGAACTTCAC-3rsquo;；下游引物：VP1-R：5rsquo;-ACCACTCTAAAGTTGCCCAC-3rsquo;。 该引物扩增全长1015bp的片段，采用TAKARA公司的一步法试剂盒进行基因扩增，反映条件：42℃反转录30min； 95℃预变性3min，以95℃ 30s、58℃ 70s、72℃ 1min扩增30个循环；72℃后延伸10min。使用1%琼脂糖凝胶电泳观察是否出现预期的PCR产物。 1.4 VP1基因序列测定与分析 利用ABI3730全自动基因测序仪对EV71VP1基因序列进行双向核苷酸序列测定，测序结果使用DNAstar生物软件进行分析处理，参考株基因序列来自GENBANK。 2 结果 2.1 流行病学概况和病原检测结果 2011年共检测本市HFMD病例各类标本332份，检测到总肠道病毒核酸阳性278份，总检出率为77.58％；男性167份，女性111份，发病人群主要集中在1-5岁年龄组，有较明显的季节性，发病主要集中在4～7月。 EV71病毒核酸阳性165份，检出率59.3%；CoxA16病毒核酸阳性98份，检出率35.25%；其他肠道病毒15份，检出率5.39%。EV71的检出率高于CoxA16和未分型标本。 2.2 VP1序列测定和同源性分析结果 从以上EV71阳性标本中选出15份代表性样本进行基因扩增和序列测定，结果显示15株EV71 VP1区核苷酸序列长度都是891bp，编码297个氨基酸。本研究的15份EV71在VP1区核苷酸和氨基酸同源性很高，核苷酸和氨基酸同源性分别在97.5%～99.9%和99.4%～100%之间；与基因库（GenBank Database）检索到EV71代表株VP1序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析，本地区EV71的VP1 区与C4基因亚型核苷酸和氨基酸同源性在92.1%～99.8%和96.4%～100%之间；与C4a基因亚型的核苷酸和氨基酸同源性最高在93.8%～99.5%和98.2%～100%之间；与A、B型的核苷酸和氨基酸同源性较低；与CoxA16核苷酸和氨基酸同源性最低。 进行序列位点分