实验3环境中微生物的检测和.ppt1.pptVIP

实验三 环境中微生物的分离和纯化 一、实验目的 1）了解培养基的制备原则和制备程序，熟悉常用培养基的名称 2）掌握微生物的分离、接种技术 3）了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围，掌握高压蒸汽灭菌的操作方法 二、实验内容 1）培养基的制备 2）高压蒸汽灭菌法、干热灭菌法 3）用平板划线法和稀释法分离微生物 4）无菌操作技术 三、实验原理 一）灭菌实验原理 微生物实验所用的培养基、玻璃器皿、水、金属用具及具有传染性的标本均需用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。 高压蒸汽灭菌是把待灭菌的物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅中，将锅内冷空气排净后，当锅内压力为0.1Mpa时，温度可达121℃、维持20min，即可杀死一切微生物的营养体及孢子。 高压蒸汽灭菌原理 当温度过高时，营养成分会破坏，所以含有糖类等成分的营养培养基可用低温进行灭菌 （0.07 Mpa，115.5℃，30 min）。 干热灭菌是把待灭菌的物品放在干燥箱中，当温度160℃时，维持2h，即可达到灭菌目的。 干热灭菌适用于玻璃器皿、金属及药物干粉等的灭菌。 注意：干热灭菌的温度不能超过180℃，且只有待温度降至80℃以下才能打开箱门。 4.试剂 NaoH、HCL、无菌水 培养皿、锥形瓶、试管及试管帽、涂布耙、枪头、酒精灯、试管架、PH试纸等。 5.实验用具 五、实验步骤 称量→溶化 测定及矫正pH （过滤） 分装 灭菌备用（若配制固体平板培养基，则先灭菌后再倾倒平板备用。） （一）培养基的制备 适当的营养成分；合适的酸碱度；灭菌后方可使用。 培养基的制备程序： 培养基的制备原则： 培养基制备过程： 称量：按培养基配方及配制的总量计算并称量各种培养基成分（注：称量牛肉膏时，先称玻棒重量后用玻棒取样，再称量。） 溶解：将各种成分放入三角瓶，加蒸馏水或自来水（完全培养基用）至所配培养基的总量，放微波炉中加热溶解。 过滤：用滤纸或多层纱布过滤 (如无特殊要求，此步可省略) 。 调pH值：用NaOH或HCL调pH至所需范围。 分装：根据配制培养基的不同进行分装（液体培养基先分装后灭菌，固体培养基先灭菌后分装） （1）液体培养基：将配制的液体培养基分装到试管或三角瓶中（注：分装试管时，培养基装量为3-4ml；分装三角烧瓶时，培养基装量以不超过三角烧瓶容积的1/2为宜）。 （2）固体培养基：斜面培养基一般装量为5ml左右。 （3）固体平板培养基：每一平板的培养基装量为 15-20ml。 加塞、包扎和灭菌： 分装后的培养基，试管用试管帽，三角瓶用封口膜封好瓶口，贴上标签，注明培养基的名称及配制日期后放入高压灭菌锅内灭菌。 灭菌时注意排空灭菌锅内空气，灭菌锅压力为0.1 Mpa(121℃)，维持20-30min。 摆斜面和倒平板： 摆斜面：将灭菌后的试管摆放形成斜面，斜度要适当，斜面长度约为试管长度的1/2，培养基上部离管口5 cm以上。 倒平板：待培养基冷却至60-70℃时，无菌操作将培养基倒入已灭菌并干燥的平皿中，使其布满皿底。每皿装量15-20 ml（?90mm），厚度达2-3 mm，倒平板时，一般叠放平皿，以免过多蒸汽凝结在皿盖上，等凝固后 翻转平皿。 培养基的分装 斜面培养基的摆法 平板培养基的制法 平板化线法示意图 （二）平板培养基接种法 注意事项： 划线接种时要掌握好角度和力量（划线时接种环与培养基表面约呈45度角），不可划破平板表面；划线要密而不重复，充分利用平板表面：严格无菌操作。 接种完毕，盖好皿盖，接种环经火焰灭菌，注明姓名、日期、标本名称等，置所要求温度的培养箱培养24h后观察结果。 （三）试管斜面接种 接种环在火焰中灼烧灭菌后，从菌种管挑取少量菌苔 斜面划线接种示意图 将挑取少量菌苔的接种环伸进斜面的底部向上划一直线，然后再从底部向上进行蛇行划线。 接种完毕，将管口再经火焰灭菌，盖好试管帽，接种环灼烧后放回原处