微生物 10-4、5、6第十章 微生物的遗传变异和育种.ppt

第五节分子育种（基因工程育种） 特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性 一、基因工程 定义：在基因水平上，改造遗传物质，从而使物种发生变异，创建出具有某种稳定新性状的生物新品系。 获得目的基因 选择基因载体 体外重组 外源基因导入 筛选和鉴定 应用 二、基因工程的基本操作 通过基因工程改变后的菌株被称为“工程菌”，工程菌已逐渐应用于药物的微生物发酵生产中，主要有以下几个方面：①增加生物合成基因量而增加抗生素产量；②导入强启动子或抗性基因而增加抗生素产量；③把两种不同的生物合成基因在体外重组后再导入受体而产生杂交抗生素；④激活沉默基因，以其产生新的生物活性物质或提高抗生素产量；⑤把异源基因克隆到宿主中表达，以期彻底改变生产工艺。 工程菌的稳定性问题 由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原、人促红细胞生成素、重组链激酶等都已先后供应市场，不仅保证了这些药物的来源，而且使成本大大降低。但工程菌在发酵生产和保存过程中表现出不稳定性，具体表现为：质粒的丢失；重组质粒发生DNA片断脱落；表达产物不稳定。 工程菌的稳定与否，与重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性以及环境条件等因素有关。 防止或降低工程菌的不稳定的措施： ①组建合适的载体，引入一段特殊的DNA片断或基因使宿主细胞在分裂时，质粒能较稳定的遗传到子代细胞中； ②选择适当的宿主，相对而言重组质粒在大肠杆菌中的稳定性大于枯草杆菌和酵母； ③施加选择压力，即利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能生长，常用方法有抗生素添加法、抗生素依赖变异法、营养缺陷型法； ④控制外源基因过量表达，外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定； ⑤控制培养条件； ⑥在构建质粒时，插入能改良宿主细胞生长速率的特殊DNA片断； ⑦避免使用带有可转移因子的质粒； ⑧将质粒上的不需要的DNA部分除去； ⑨在发酵过程中将工程菌固定化可以提高工程菌的稳定性。 第六节 菌种的衰退、复壮和保藏 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染； c）死亡。 一、菌种的衰退与复壮 菌种衰退的原因： ①大量群体中的自发突变 纯菌种 自发突变 不纯菌种 突变个体 传代增殖 原始个体 衰退菌种 衰退：菌种出现或表现出负变性状 菌种衰退的原因： ②分离现象。 菌种衰退的原因： ③培养条件与传代。 1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。 a）纯种分离； b）通过寄主体进行复壮； 2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。 菌种的复壮： 二、防止衰退的措施 1）减少传代次数； 2）创造良好的培养条件； 3）利用单核体传代 4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查； 5）采用有效的菌种保藏方法； 三、菌种保藏 目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用 基本原则：1、挑选典型菌种的优良纯种 2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体 3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温） 4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株 菌种保藏是指广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上，将之妥善保藏，使之达到不死、不衰、不污染，以便于研究、交换和使用。 基本方法 培养基传代培养（斜面、平板） 寄主传代培养 低温（液氮、低温冰箱） 干燥（沙土管、真空干燥） 生活态 休眠态 1. 斜面保藏法 将菌种接种于斜面培养基上培养，培养成熟后置于4℃冰箱保藏。是一种短期的菌种保藏方法，广泛用于放线菌、细菌、酵母菌和丝状真菌。 保藏的斜面每隔1-3个月要移接一次，继续保藏；移接代数最好不要超过3-4代。 斜面保藏的不足：菌种生长未停止，可能自发突变；易变异和退化；水分易蒸发，引起菌种退化甚至死亡。 2. 液体石蜡保藏法 直接将无菌无水的液体石蜡加入生长好的菌种斜面上，置于4℃保藏。也是一种斜面保藏法， 优点是防止培养基水分蒸发并隔绝氧气。 缺点是必须直立，占据较大空间。不适于以石蜡为碳源或对石蜡敏感的菌种。 3. 干燥保藏法 ⑴ 砂土保藏法 制作时沙和土以1：1或3：2混合装管灭菌。 优点：经济简便，保存时间