武汉大学医学院答辩.ppt

5.1 gtfB PCR扩增产物电泳结果 5.2 PCR-RFLP结果分析 内切酶BsrI 识别5’- ACTGGN↓- 3’ ，B基因型1422bp位点碱基由A→G，导致1419-1424bp片段由5’- ACTAGC- 3’突变为5’- ACTGGC↓- 3’而产生B基因型 5.3 gtfC PCR扩增产物电泳结果 5.4 PCR-RFLP结果分析 * To study Urumqi Municipality Uighur different caries sensitive children of Streptococcus mutans clinical isolates adhesion , synthesize exopolysaccharides and related gene polymorphism 乌鲁木齐市维吾尔族不同龋敏感儿童变形链球菌临床分离株黏附、产糖及相关基因多态性研究 本课题由导师赵今教授的博士后后续基金资助！ 于一附院临床检验中心及科技楼分子生物学实验室完成！ 目录 研究背景 研究内容与方法 结果 讨论 小结 发表论文 致谢 慢性细菌性、病程长、易忽视 心血管疾病 神经系统疾病 邻组织器官感染性疾病 胚胎发育 儿童发育不良 消化系统疾病 泌尿系统疾病 牙源性病灶 危 害 一、研究背景 乳牙龋病是儿童口腔常见疾病，严重影响儿童身心发育及健康。 我国儿童乳牙患龋率很高，远远超过发达国家。 龋病发生的主要原因 变形链球菌 合成胞外 多糖 黏附 产酸、耐酸 主要实验试剂与培养基 研 究 内 容 32株源自无龋组（dmft=0） 前期分离、鉴定所得的64株变链菌临床分离株 实验菌株 32株源自高龋组（dmft≥5） 样本含量计算公式： 指标一 不同龋敏感儿童变链菌黏附能力比较 试管内加入菌悬液和液体培养基 黏附细菌洗脱法 比浊法 高龋、无龋组 黏附比 指标二 不同黏附能力菌株表面蛋白遗传多态性分析 高黏附力组 （黏附比＞35%）19株 不同黏附能力 菌株 低黏附力组 （黏附比＜20%）13株 5 step 4 step 3 step 2 step 1 step 提取细菌 基因组DNA 设计引物 目的基因 扩增 PCR-RFLP 基因多态性分析 引物序列表 指标三 不同龋敏感儿童变链菌生物膜状态下合成EPS能力的比较 WSG 蒽酮法 生物膜状态 WIG 指标四 变链菌不同WIG合成能力菌株糖代谢相关基因遗传多态性的比较 实验菌株 合成WIG高组 （OD值0.35） 18株 不同WIG合成能力菌株 合成WIG低组 （OD值0.15） 12株 基因多态性分析 提取细菌 基因组DNA STEP 1 设计引物 STEP 2 目的基因扩增 STEP 3 PCR-RFLP STEP 4 引物序列表 统 计 方 法 采用SPSS19.0软件包进行统计分析。其中两组均数比较采用t检验；各组基因型分布采用卡方检验。α=0.05时比较差异是否具有统计学意义。 三、结 果 1. 变链菌复苏、传代 2. 高龋及无龋组变链菌玻壁黏附比（%） 3.1 DNA定量 抽提变链菌临床株全菌基因组DNA浓度为500-700μg/mL，共获得30-50μg的纯化基因组DNA。所有实验菌株OD260nm/OD280nm比值均在1.7-1.9之间。说明抽提产物无蛋白质、酚污染。 3.2 spaP-a PCR扩增产物电泳结果 3.3 PCR-RFLP结果分析 内切酶HaeⅢ识别5’-GG ↓ CC-3’ ，853bp-856bp处5’-AGCC-3’片段突变为5’-GG ↓ CC-3’，从而出现了B基因型 3.4 spaP-pv,spaP-c PCR扩增产物电泳结果 3.5 PCR-RFLP结果分析 4. 蒽酮法测定胞外多糖含量 回归方程为：y(葡萄糖量)=1.265X（吸光度）-0.2906 经直线回归方程统计分析检验，F=145.083，P=0.000 相关系数r=0.980