电泳技术参考课件.pptx

电 泳 技 术 ; 带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis，简称EP )。1937年瑞典科学家Tiselius建立了“移界电泳法(moving boundary EP)”，成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖金。 50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关的医学、农、林、牧、鱼、制药、某些工业 分析中必不可少的手段。 ;第一节 基本原理 一、泳动度 带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度(mobility)，可用下式表示： U=v/E=(d/l)/(V/l)=dl/Vt 式中，U(也可以用m表示)为泳动度(cm2/V穝)；v为颗粒泳动速度(cm/s)；E为电场强度(V/cm)；l为支持物的有效长度(cm)；V为实际电压(V)；t为通电时间(s或min)。电泳后通过侧量V,t,d,l，即可计算出被分离物质的泳动度。 泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为： F=EQ 式中，E为电场强度，即每厘米支持物的电位降，Q为被分离物所带净电荷。 根据Stoke定律，一球形分子在液体中泳动所受的阻力(摩擦力)F′为： F′=6πrηv 式中，η为介质粘度，r为分子半径，v为分子移动速度。 当平衡时：F=F′，即 EQ=6πrηv ∴ v=EQ/6πrη ∵ U=v/E ∴ U=Q/6πrη 由上式可见泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷有关。 ;二、影响泳动度的因素 1.电场强度 电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动 越快。根据电场强度的不同，电泳可分为： (1)常压(100-500V)电泳。其电场强度为2-10V/cm。分离时间较长，从数小时到数十小时 ，适合于分离蛋白质等大分子物质。 (2)高压(2000-10000V)电泳。其电场强度为50-200V/cm，电泳时间很短，有时只需几分钟 。多用于分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。 2.溶液pH 为使电泳时pH值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液的pH值决定带电颗粒的解离程 度，亦即决定其所带电荷的多少。对蛋白质而言，溶液pH值离等电点(pI)越远，则颗粒 所带的净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢。因此分离某种蛋白质混合液时，应选择一个合适的pH使欲分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大的差异。;3.溶液的离子强度 缓冲液离子强度越高，则颗粒的电动电势越小，泳动度也越小。一般最适合的离子强度在0.02-0.2之间。溶液离子强度(ionic strength)的计算公式如下： I=1/2Σcz2 式中，I为离子强度，c为离子的摩尔浓度(mol/L),z为离子价数，价数越高，则离子强度越大。 如：求0.015mol/L Na2SO4的离子强度。 Na2SO4? 2Na++SO42- I=1/2(0.015×2×12+0.015×22)=0.045 4.电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电泳时，滤纸吸附OH-离子带负电荷， 与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响，故电泳时，电渗小些为好。 ;5.温度 电泳时会产生焦耳热，使介质粘度下降，分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使样 品中的生物大分子变性失活，因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。 6.支持物 现代的电泳多在固体支持物上进行，使样品中的不同组分形成不同的区带，称区带电泳。电泳结束后，支持物可以很方便地进行染色等后续处理，因此，