酶工程第五章 酶的分离纯化.pptVIP

Chapter ５ Modification of Enzyme Molecule; ; 酶一旦离开生物细胞离开其特定的作用环境条件，常常变得不太稳定，不适合大量生产的需要； 酶作用的最适pH条件一般在中性，但在工业应用中，由于底物及产物带来的影响，pH值常偏离中性范围，使酶难于发挥作用； 在临床应用上，由于绝大多数的酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗原性，直接注人会引起人体的过敏反应。?;改变酶特性有两种主要的方法： 一是通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的结构； 二是通过生物工程方法改造编码酶分子的基因，从而达到改造酶的目的。 近年来应用蛋白质工程改造酶的一个成功例子是磷脂酶的修饰，修饰后酶变得更耐酸，现已广泛地用作食品乳化剂。?; 酶分子是具有完整的化学结构和空间结构的生物大分子。 酶分子的结构决定了酶的性质和功能。; 酶分子修饰是指通过对主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造。 改造的目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用以达到较高的经济效益。 同时通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探讨其结构与功能之间的关系， 所以，酶分子修饰在酶学和酶工程研究方面具有重要的意义。 ;酶分子修饰的意义;５.2 酶分子修饰的基本要求和条件 ;酶分子修饰的条件;５.3 酶分子的修饰方法 ;(1) 酶的金属离子置换修饰;若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。 如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。 若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。①有的可以使酶的活性降低甚至丧失， ②有的却可以使酶的活力提高或者增加 酶的稳定性。;金属离子置换修饰的过程 ;c.加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。 ;(2) 酶的大分子修饰;一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。 另一类添加物就是蛋白质。 蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。;用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍 ;大分子修饰(共价)的过程;修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。 分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。 ;聚乙二醇是线性分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。;(3) 酶分子的侧链基团修饰;催化活性/非催化活性基团的修饰;氨基酸;常见基团的化学修饰反应：羧基;常见基团的化学修饰反应：氨基;常见基团的化学修饰反应：巯基;常见基团的化学修饰反应：咪唑基;常见基团的化学修饰反应：酚羟基;常见基团的化学修饰反应：胍基;常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基; 但解释修饰效果须十分小心，因为： ①任何一种修饰剂不是绝对专一的。 ②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰。 ③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。;(4) 酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰);;b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 ;;c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活 ;氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，B