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实验十三　链孢霉四分子分析（３学时） 一、教学基本要求：1、 了解粗糙脉孢菌的生活周期及特性。2、 学习顺序四分子的遗传学分析方法 二、教学内容： 〖目的和要求〗要求学生加深了解顺序四分子分析的原理和方法，增加链孢霉杂交的感性认识，并能进行有关基因的着丝粒距离的计算和作图。从而正确认识和验证分离和交换定律，并了解基因转变现象。 〖实验原理〗　　1、原理： 基因分离 ——第二次减数分裂分离。 〖〗 〖〗 1Lys+,接合型。 2．粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株，Lys-，接合型a。 〖〗 1 2．培养基 （1）基本培养基（野生型可生长，缺陷型不能生长）：50倍浓度的贮存液 ?? 柠檬酸钠???? ??125克 ?? ???????????????????????????????250克 ?? ???????????????????????????????100克 ?? ???????????????????????????10克 ?? ?????????????????????????????5克 ?? 生物素溶液（5毫克/100毫升）??????????? 5毫升 ?? 微量元素溶液 ?? ?? 氯仿????????????????????????????????? 1毫升 蒸馏水???????????????????????????? 1000毫升 氯仿（防腐） ?????????????????????????2-3毫升 用前稀释贮存液，再加1.5%的蔗糖，PH5.8。如加2%琼脂，即成基本固体培养基。 （2）补充培养基：在基本培养基上补加一种或多种生长物质，如氨基酸、核酸碱基、维生素等。氨基酸用量一般是100毫升基本培养基中加5-10毫克。 本实验所用的补充培养基只要在基本培养基中加适量的赖氨酸，赖氨酸缺陷型菌株就能生长。 （3）完全培养基 ? 基本培养基理论???????????????????????????? 1000毫升 ? 酵母膏?????????? ???????????????????????????????5克 ? 麦芽汁（亦可不加）????????????????????????????? 5克 ? 酶解酪素??????????????????????????????????????? 1克 ? 维生素混合液 ? ? 蔗糖?????????????????????????????????????????? 20克 （为获得大量分生孢子，可用1%的甘油代替蔗糖。） 如加2%琼脂，即为完全固体培养基。 （4）麦芽汁培养基：可以代替完全培养基，配方简单。8波美麦芽汁2份，蒸馏水1份，再加2%琼脂。 （5）马铃薯培养基：也可以代替完全培养基。将马铃薯洗净去皮，切碎，取200克，加水1000毫升，煮熟，然后用纱布过滤，弃去残渣，滤下的汁加2%琼脂，20克蔗糖，煮融，分装到试管中。也可将马铃薯切成黄豆大小的碎块，每支试管放3-4粒，再加入融化好的琼脂、蔗糖。 上述培养基都需分装到试管后，在8镑压力下消毒30分钟，取出斜摆，成为斜面备用。 （6）杂交培养基： 生物素??????? 20微克（或5毫克/100毫升溶液0.4毫升） 微量元素溶液?? 1毫升 （成分同基本培养基中微量元素液配成4倍浓度的溶液稀释使用） 蒸馏水????? 1000毫升 蔗糖??????????? 20克 PH6.5 加2%琼脂即成固体培养基。 （7）杂交培养基： 将玉米在水中浸软，破碎，每试管放2-3粒，加入少量琼脂(0.1克左右)，再放入一小片经多次折叠的滤纸（长约3-4厘米），加上棉塞，消毒即成，不需摆斜面。 3．药品：5%次氯酸钠（），5%石碳酸。 〖〗 128℃温箱培养5天左右。培养到菌丝的上部有分生孢子产生。 2．杂交：接种亲本菌株，可采用下述方法。 （1）同时在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝，25℃温箱进行混合培养。注意要贴上标签，写明亲本菌株及杂交日期。在杂交后5-7天就能看到许多棕色的原子囊果出现，以后原子囊果变大变黑成子囊果，在7-14天左右，就可在显微镜下观察。 （2）在杂交培养基上接种一个亲本菌株，25℃培养5-7天后即有原子囊果出现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，悬浊于无菌水中（近于白色的悬浊液），将此悬浊液加到形成原子囊果的培养物表面，使表面基本湿润即可（每支试管约加0.5毫升），继续在25℃培养。原子囊果在加进分生孢子1天后即可开始增大变黑成子囊果，7天后即成熟。 3．显微镜观察： （1）在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以防止分生孢子飞扬。 （2）取一载玻片，滴1-2滴5%次氯酸钠，然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上（若附在子囊果上的分生孢子过多，