MTT法测定硫酸长春新碱对Hela细胞增殖的抑制效果.docVIP

MTT法测定硫酸长春新碱对Hela细胞增殖的抑制效果 摘要：目的 探索VCR对Hela细胞增殖抑制效果的最适浓度，并探究其作用机理。方法 用不同浓度的VCR作用于处于生长对数期的Hela细胞，MTT法测定细胞存活状况，比较抑制效果。结果 浓度设置抑制效果差异性不明显，由于操作不规范性等因素引起的浓度与抑制率不呈一定的相关性规律。结论 在设置的浓度范围内，诱导浓度为0.4 ug/ml对Hela 细胞增殖的抑制效果最佳。 关键词: 硫酸长春新碱；子宫癌细胞；MTT法；抑制率 1 前言 调查资料表明2002 年全球癌症患者达1090万其中死亡670万在过去五年中诊断出2460万肿瘤患者( Parkin等 2005) ，世界卫生组织估计若严格统计可能更严重[ 1 ] 。宫颈癌是一种严重的危害妇女健康的疾病在全球妇女恶性肿瘤的发生率中宫颈癌仅次于乳腺癌而位居第二。其治疗以手术切除为主,辅以放疗、化疗和其它治疗方法。在综合治疗中,化疗以其能缩小原发病灶,防止术后复发和扩散有重要的作用。 长春新碱(Vincristine，VCR)是二聚吲哚类生物碱。自它于1962 年问世以来，一直是重要的一线抗癌药物[2-3]。VCR 通过作用于肿瘤细胞微管蛋白而干扰肿瘤细胞代谢，本研究选用不同浓度的VCR作用于体外培养的Hela细胞, 测定宫颈癌Hela细胞对同一药物的不同浓度敏感性。 2 材料与方法 2．1材料与仪器 Hela细胞 酶联免疫检测仪 2．2 实验步骤 1. 接种：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为2～3?104/ml，每孔加入细胞悬液200μl，使每孔内的细胞数为4000- 6000个。 2. 培养与药物处理：培养箱内培养24～36h，吸出培养液加入不同浓度梯度的VCR 200 μl，每个浓度接种4孔作为重复实验，并设置空白对照。 3. 呈色：培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 μl，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO 150μl，振荡30min，使结晶物充分融解。 4. 比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。 2．3数据处理 细胞增殖抑制率＝（未加药物处理的对照组吸光值－药物处理组的吸光值）/未加药物处理的对照组吸光值。 T检验[4]测定不同浓度VCR对Hela细胞的抑制率的差异度 3 结果与分析 表1 硫酸长春新碱不同诱导浓度处理Hela 后细胞增值抑制率a) 诱导浓度（ug/ml） 细胞增殖抑制率(%) 诱导浓度（ug/ml） 细胞增殖抑制率(%) 0.2 60.81 1.0 47.58 2.0 41.98 4.0 43.00 1.5 71.06 4.5 69.96 7.5 66.30 10.5 65.20 a)表中所列为同一批次 Hela 细胞同时处理的结果 由表可知：诱导浓度由0.2～4.0 ug/ml，细胞增值抑制率由60.81％降低至43.00％，差异不明显（P0.05）；诱导浓度由1.5~10.5 ug/ml，细胞抑制率由71.06降低至65.20％，差异不明显（P0.05），不具统计学意义。由此可见，VCR的最适浓度设置应将浓度梯度设置更大，并且倾向浓度低方向进行。 有实验证明VCR的诱导浓度为0.4 ug/ml时，抑制率为82.2％[5]。介于1.0至2.0 ug/ml之间的抑制率在另一组1.5 ug/ml却为71.06％，与1.0ug/ml、2.0 ug/ml，差异显著。由此可见，实验数据存在一定的误差，引起误差的原因有：一 培养的细胞质量存在较大差距：并不是都是用处于生长对数期的细胞进行处理，组与组之间的细胞浓度差距；二 吸出培养液加入不同浓度梯度VCR培养三天，培养液被吸出，细胞所需的能量供应不足，吸出的量不一样，导致细胞生长情况不一致； 三 加入MTT培养四小时后，弃去上清液，若上清液有残留，则影响光吸收值的准确性；四 由于仪器或者操作不规范等人为的原因，造成的实验误差。 表2 硫酸长春新碱不同诱导浓度处理Hela 后细胞增值抑制率b) 诱导浓度（ug/ml） 细胞增殖抑制率(%) 诱导浓度（ug/ml） 细胞增殖抑制率(%) 0.05 20.42 0.1 65.05 0.2 71.58 0.4 80.84 0.156 18.76 0.312 54.08 0.625 57.17 1.25 66.00 b)表中所列为同一批次 Hela 细胞同时处理的结果 由表2可知：两组处理的细胞抑制率均随药物浓度增大而增加，诱导浓度为0.4 ug/ml抑制率高达80.84％，这与相关报道相符合；在这批次中，诱导浓度为0.1～0.