钙调蛋白神经保护作用的体外研究.docVIP

精品论文 参考文献 钙调蛋白神经保护作用的体外研究 刘宝莲（山东省蒙阴县人民医院药剂科，山东蒙阴 276200） 摘 要：目的探讨钙调蛋白Calmodulin（CaM)神经保护的作用及相关机制。方法0.32mM 异氟烷处理培养一周后的神经细胞12h，异氟烷处理前提前两天在培 养基中加入钙调蛋白,将细胞随机分为溶剂对照组（control 组）、异氟烷处理组（iso 组）和异氟烷加钙调蛋白组（iso+ CaM 组），检测细胞的MTT，对细胞进行 Hoechst33258 荧光染色观察凋亡细胞并计数。结果control 组的MTT 值明显高于iso组和iso+ CaM 组（P lt; 0.05）,凋亡细胞计数明显低于iso组和iso+ CaM 组（Plt; 0.05）；iso组MTT 值明显高于iso+ CaM（P lt; 0.05），凋亡细胞计数明显低于iso+ CaM（P lt; 0.05）。结论0.96mM 的异氟烷处理2h 对小鼠的神经元产生了明显 的毒性；钙调蛋白能明显减轻异氟烷的神经毒性。 关键词：钙调蛋白；异氟烷；原代培养；神经元 中国图书资料分类号文献标识码 钙调蛋白Calmodulin（CaM）是细胞内一种主要的Ca2+受体信号 系统调控蛋白，CaM 能够激活钙调蛋白依赖性的PDE、钙神经素、钙 调蛋白激酶CaM-Kinase(CaMKs)。目前的研究发现钙调蛋白能够介导 脑中CaMKs 磷酸化并调节大量的蛋白底物，CaMKs 在脑中含量极为 丰富，CaMKs 能调节神经递质的释放，对神经系统中突触的形成和神 经行为等方面有重要作用1 。近年来的许多研究发现了吸入麻醉 药异氟烷的神经毒性作用，特别是其对发育中的动物神经系统的影响 2 。本实验采用神经细胞体外培养的方法，从细胞水平探讨给予 CaM 后对异氟烷神经毒性的影响，从而进一步确定CaM 对神经细胞 的保护作用。 材料与方法 一、材料 SPF级孕16-17 天的昆明小鼠，由第四军医大学实验动物中心提 供。胎牛血清（杭州四季青）；Neurobasal 培养基（美国Introgen）； 0.25％胰酶、L-多聚赖氨酸、B27、双抗、MTT、DMSO、Hoechst 33258 染色液(美国Sigma)；异氟烷（美国Baxter）；其他试剂均为进口或市 售分析纯；CO2 培养箱（美国Revco）；二氧化碳培养箱(美国SHELL ／JB)；XDS 一1B 倒置显微镜(重庆光电仪器有限公司)；ElxS00 酶标 仪(德国Bio2tek 仪器公司)。 二、细胞分组 分为:①对照组；②异氟烷0.96mM组; ③异氟烷0.96mM+ CaM5uM 组; 三、小鼠大脑皮层神经元分离、培养 参考文献3 的方法并做适当改进：选用怀孕16-17 天的昆明 小鼠，常规消毒后无菌条件下颈椎脱臼处死断头取脑，在预冷的 D—Hanks 液中解剖分离大脑皮层，解剖显微镜下去除脑膜和血管， D—Hanks液洗2～3 次，剪成lmmtimes;lmmtimes;lmm 左右的小块，0.25％胰 蛋白酶37℃消化20min，取出吹打，并用含10％胎牛血清的DMEM 培养基终止反应。1000r／min 离心5min，弃上清液，用D—Hanks液 洗1 次，再离心，弃上清液，用含10％胎牛血清的DMEM 培养基调 节细胞悬液浓度为5times;105／ml，接种于经0.01％多聚赖氨酸包被过夜 的培养板中，放入37 C 恒温的CO2 培养箱内(95％空气和5％CO2， 湿度85％～98％)培养。48h后全量换液。以后根据培养基颜色变化， 每2～3d半量换液1次。细胞培养至7d，经神经元特异性烯醇化酶(NSE) 免疫细胞化学法鉴定，神经元占全部细胞总数的80％以上，仅少数 细胞是星型细胞和其它胶质细胞。取培养7d 的神经细胞进行实验。 四、异氟烷溶液的配制 用改良的 Blanck 和Thompson法配制可溶解于培养基的异氟烷溶 液. 10 mM 的异氟烷溶液的配制方法：将130 mu;L 液体异氟烷 (1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether; Abbott Laboratories Inc., Chicago IL)加入103 mL BSS 中，100-mL 容积的棕色容量瓶盛装。 玻璃瓶塞封口防止气体扩散。配好的溶液在摇床上摇匀24h 以充分溶 解异氟烷。使用前迅速将30 mL溶液倒入50mL聚丙烯离心管中，震 荡5-10s制成日常储备液。用BSS 将日常储备液稀释0.96m