聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸——DNS-Cl法 实验报告.docVIP

生物化学实验报告 题目：聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸——DNS-Cl法 姓名：余振洋 学号：200900140156 系年级：09级生科3班 同组者：张刚刚 时间：2011/4/16 一．【实验目的】 1.了解并掌握DNS-氨基酸制备和鉴定的原理及方法。 2.掌握聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸的操作和方法。 二．【实验原理】 荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯（5-dimethylamino-1-naphthylene sulfonyl chloride，Dansyl ch1oride，简称DNS-Cl）在弱碱性（pH9.0 左右）条件下可与氨基酸的α-氨基反应，生成带黄色荧光的 DNS- 氨基酸。 DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法分离，所得层析图与DNS-标准氨基酸层析图谱相对比，可借此鉴定样品中氨基酸的种类，用此法鉴定蛋白质N-末端氨基酸比FDNB法灵敏100倍，仅 10-10～10-9mo1样品即可检出，产物也比DNP-氨基酸稳定，且操作简便、快速。 DNS-Cl在pH值过高时，会水解产生副产物DNS-OH，反应时如下： 在DNS-Cl过量时，又会产生DNS-NH2，反应式如下： 在紫外光照射下，DNS-OH 和DNS-NH2 产生蓝色荧光，而 DNS- 氨基酸产生黄色荧光，可彼此区分开。 三．【实验材料】 1.器材： 小离心管 紫外灯（波长254nm或265nm）。 37℃恒温水浴。 电吹风。 层析缸（10cm×20cm）。 毛细管（点样管）。 聚酰胺薄膜。 容量瓶（100ml）。 移液管（2ml）。 培养皿,移液枪,移液管。 2.试剂： ①DNS—Cl丙酮溶液：称取25mg DNS—Cl溶在10ml丙酮中。 ②展层液：甲酸∶水=1.5:100（V/V）。 ③氨基酸样品：标准丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸以及混合氨基酸液。 四．【实验步骤】 1.DNS-氨基酸的制备 取4只离心管，分别加入标准丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸及混合氨基酸30μl，再各加入DNS—Cl丙酮溶液30μl，混匀后放入37℃恒温水浴中保存1h。 2.点样 取聚酰胺薄膜一张，在距离一端1cm处用铅笔画一直线，在直线上取间距1cm的四点，作为点样原点。用毛细管取上步制得的DNS-氨基酸液进行点样，点样直径不超过2mm，重复2—3次，每次点样后用冷风吹干再点下一次，吹干。 3.展层 将上述聚酰胺薄膜光面向外卷曲（两边不接触）外扎以牛皮筋，直立于盛有 展层液12-13ml的培养皿盖或10ml的培养皿底中，盖上500ml 烧杯。当展层剂上升到距离顶端大约0.5cm时结束，取出，冷风吹干。 4.结果观察 将聚酰胺薄膜置于紫外灯下，观察荧光斑点，区分DNS-氨基酸，DNS-NH2与DNS-OH，用铅笔在黄绿色斑点边缘轻轻画图做记号，将样品图谱与标准图谱对比找出各种氨基酸相应的位置。 五．【注意事项】 1.在DNS-氨基酸制备时，DNS化必须在碱性条件下（pH9.0左右）进行，否则会有很多副产物DNS—NH2或DNS—OH产生。 2.点样点要小、圆、量要适当，否则拖尾，因此毛细管要细，头要平，点上后立即拿开，样品浓度要合适，聚酰胺薄膜要选择优质的。点样直径不宜超过2mm，点样后立即吹干，同时点样力度不宜过大，防止把薄膜穿透而影响最终结果。 3.点样点间距不能太小，以免相互干扰；点样点距薄膜边缘不能太近，否则会产生边缘效应。 4.每次点样后，立即吹干，才可进行下一次点样，否则液体扩散，点样面积过大，影响展层效果。 5.展层剂液液面要低于点样点，但也不能太低。 6.紫外光对人体有害，因此要尽量缩短在紫外灯下的观察时间，注意不要把头伸到灯下观察。 六．【实验结果】 1.绘图 图一 DNS氨基酸聚酰胺薄膜层析结果（1. DNS-Ala 2.DNS-Phe 3.DNS-Lys 4.DNS-双-Lys） 2.Rf值的计算： Rf= 注：上式中x代表色斑中心至原点中心的距离，Y代表展层剂前缘至原点中心的距离。其中，Y值经测量，统一为5.7cm。 在混合氨基酸中： 1. 对于丙氨酸：X1=3.50cm ， 则Rf1 =0.61 2. 对于苯丙氨酸：X2 =1.50cm ，则Rf3 =0.26 3. 对于赖氨酸：X3 =0.90cm ，则Rf3 =0.16 X4 =4.50cm ，则Rf4 =0.79 各个标准氨基酸与混合氨基酸中的对应成分Rf值相同。 七．【结果分析及讨论】 从上述实验结果可以分析出：混合氨基酸中同时含有赖氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸三种氨基酸。 同时可以看到，薄膜上代表同一氨基酸的荧光点的位置并不完全在同一水平线上，而相互有错落，造成这