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精品论文 参考文献 黄曲霉毒素检测方法分析 陆春光 　　（黑龙江省中医药科学院 黑龙江哈尔滨 150036） 　　【摘要】 目的：探讨黄曲霉毒素的检测方法。方法：对黄曲霉毒素的检测方法较多，现对荧光反应，产毒株的筛选法，薄层层析法，高效液相色谱法，酶联免疫吸附法进行分析。结果: 黄曲霉毒素B1、B2、G1和 G2，在天然被污染的食品中，一般以黄曲霉毒素B1最多，而黄曲霉毒素B1、B2、G1只占很小部分，B1、G1毒性强，有致癌性。结论：早期研究时根据毒素在薄层板上产生荧光颜色不同，分为黄曲霉毒素B族和G族。由于黄曲霉毒素的剧毒性，强致癌性及存在的广泛性。 　　【关键词】 黄曲霉毒素；检测 　　【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）15-0221-02 　　黄曲霉毒素是由黄曲霉产生的一种强致癌毒素，黄曲霉毒素主要来源于污染的玉米及花生油，黄曲霉毒素的检测方法较多，其生物学方法主要用于检测毒性，如鸡胚、鸭雏、大白鼠、小白鼠试验等，随灌喂毒素的多少及时间而引起动物的中毒死亡或出现肿瘤[1]。黄曲霉毒素还能产生荧光，有人将从含黄曲霉毒性的花生仁中分离出的酵母菌，接种于培养基后，培养基能产生荧光。现对检测方法分析如下。 　　1.荧光反应 　　取白色惰性硅藻土(本身无荧光)，可消除菌丝所产生的荧光干扰)，180℃干燥灭菌1小时，适量铺于平皿底，混入少量冷却至50℃的琼脂，凝固后倒入适量培养基制成平板，接种菌悬液于半个平板，30℃孵育，当生长良好时将平皿倒置，置紫外灯下观察，有特异的蓝色荧光出现，判为阳性[2]。在薄层层析板上，黄曲霉毒素B1、B2、G1与G2的荧光强度排列次序为：B2gt;G2gt;B1gt;G1，用荧光法测定黄曲霉毒素，所用的激发光波长为365毫微米，荧光波长B1、B2为435毫微米，G1、G2为465毫微米。 　　2.产毒株的筛选法 　　微栓过筛法：薄层层析法称TCL证实。即将部分净化后的提取液直接上微栓测定，毒素被硅镁型吸附剂或硅胶吸附后，在紫外光下呈蓝紫色荧光环，若无蓝紫色荧光环即为未检出。AM法筛选，TLC法证实：使用Difico公司AM培养基的配方，培养基灭菌后，分装无色比色管，用活化的菌种接种，28℃暗处培养。分别在接种后，培养4、7、14天，用cs-930扫描仪测定比色管的荧光强度，荧光强度增加1.00以为筛选阳性。阳性培养物用TLC法(国际标准法)测定和证实黄曲霉毒B1的含量，使每毫升提取液含1.69克培养物，这样最低检出量是12ppb。 　　3.薄层层析法 　　花生或花生制品样品以氯仿或70％丙酮水溶液，或甲醇：水(55：45)体积比，己烷等抽提，获样品抽提液。硅酸柱层析洗脱提纯，洗脱提纯的黄曲霉毒素以硅胶板薄层层析法测定。 　　3.1 AOAG方法(GB法) 　　用50g花生或花生制品样品加25ml水，25g硅藻土与250ml氯仿，震荡提取30分钟，过滤获样品提取液。层析朴直径22mm，长300mm，在柱底部加5g无水硫酸钠，再加上氯仿至占容积的一半高度后加入硅胶(粒度0.05～0.20mu;m)10g，以氯仿洗柱壁制层析柱，上层加无水硫酸钠，使氯仿存留高度与无水硫酸钠表面相齐，然后加样品提取液(约50ml)，以150ml己烷与150ml乙醚冲洗，最后以150ml甲醇：氯仿(3：97体积比)洗脱黄曲霉毒素，将此溶液收集挥发，加入少量氯仿在硅酸层析板上作薄层层析。展开剂为丙酮：氯仿。注意薄层层析的一些影响因素，如硅胶与硫酸钙的牌号、硅胶颗粒的大小、混入硅胶中硫酸钙比例、硅胶薄层板的厚度及含水量、展开槽中溶剂气体的组成以及展开剂种类等[3]。 　　3.2 层析板的制备方法 　　硅胶85g加15g石膏充分混合，取约3g于小研钵内加入约3倍的蒸馏水，用力研磨1～2分钟搅成糊状后倒入涂布器内推成三张厚约250mu;m的薄层板，在空气中干燥约15分钟后，或等薄层凝结后，在100℃烘2小时活化后放干燥器内待用(一般可保存2～3天)。点样以微量注射器或小毛细管点，注意标准样液约10mu;l待测液约20mu;l。观察结果可用10～125瓦紫外灯观察荧光点。 　　4.高效液相色谱法 　　用高压液相色谱(HPLC)测定黄曲霉毒素是近年较普遍应用的方法。 　　4.1 仪器 　　高压液相色谱仪(Waters公司生产)，备有6000A型泵，420型荧光鉴定器，Ex 360nm Em425nm滤光片，U6K进样器，730型数据处理机，柱10mu;m C18 10cm；FSF型样品粉碎机；FZQ-A型分析振荡器；康氏电动振荡器；具活塞玻璃层析管(8times;280nm)。 　　4.2 黄曲霉毒素(AFT