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医学论文-黑色素浓集激素受体2基因siRNA重组腺病毒载体构建及鉴定 【摘要】? 目的: 构建黑色素浓集激素受体2（MCHR2）siRNA重组腺病毒载体,并在稳定表达MCHR2的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中鉴定其干扰作用. 方法： 人工合成靶向MCHR2的siRNA干扰序列，用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSESHUS上，得到pSESHUSMCHR2siRNA，并与腺病毒骨架质粒pAdeasy1在BJ5183细菌中进行同源重组，得到pAdeasySESHUSMCHR2siRNA，在HEK293细胞中包装成重组腺病毒，感染稳定表达MCHR2的CHO细胞株, RTPCR及Western Blot检测腺病毒对细胞MCHR2表达的影响. 结果： 成功构建MCHR2siRNA重组腺病毒载体. MCHR2siRNA重组腺病毒显著抑制CHO细胞中MCHR2的表达. 结论： 构建的AdeasyMCHR2 siRNA腺病毒能有效地抑制CHO细胞中MCHR2表达，为研究MCHR2的功能及其与肥胖的关系提供了有效的工具. 【关键词】? 腺病毒载 黑色素浓集激素受体 RNA干扰 　　0引言 　　黑色素浓集激素（MCH）是中枢作用的一种神经肽，可以调节进食、能量代谢及情绪变化. David等［1］发现MCH的受体MCHR2可能是引起儿童肥胖的候选基因之一. RNA干扰(RNA interference，RNAi)是双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默(PTGS)现象，其主要生物学功能在于抵抗病毒感染，维持基因组中转座子的稳定性，清除异常RNA，并参与基因表达的调控. 我们研究小组已经筛选出了针对MCHR2的有效的干扰序列，我们用该序列构建针对MCHR2基因重组腺病毒干扰载体，在稳定表达MCHR2的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中检测干扰效果，为研究肥胖机制及其基因治疗提供新思路及新工具. 　　1材料和方法 　　1.1材料针对MCHR2基因的干扰序列1：5′AAGACGGTGTTGAGAGTTGTTTT3′;序列2：? 3′TTTTCT GCCACAACTCTCAACAA5′. 大肠埃希菌DH5α，HEK293细胞，pSESHUS，pAdeasy1,稳定表达MCHR2的CHO细胞(重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室)；限制性内切酶SfiⅠ，KpnⅠ，EcoRⅤ和T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)；限制性内切酶PacI和PmeI(New England Biolab公司)；质粒提取试剂盒（美国Omega生物技术公司）；凝胶回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；DMEM培养基(Gibico公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；RTPCR试剂盒(TOYOBO公司)和TRIZOL试剂(北京鼎国生物技术有限责任公司)；膜蛋白提取试剂盒（凯基生物发展有限公司）；MCHR2多克隆抗体、兔抗人βactin多克隆抗体(Santa Cruz公司)和辣根酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(武汉博士德公司)；所需引物均由上海生工合成. 　　1.2方法 　　1.2.1pSESHUSMCHR2siRNA载体的构建用SfiⅠ酶切pSESHUS质粒，胶回收酶切片段. 将靶向MCHR2的干扰序列退火成为双链DNA片段，克隆到酶切后的pSESHUS质粒中，胶回收连接产物，转化DH5α菌，卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，提取质粒，用KpnⅠ，EcoRⅤ双酶切鉴定正确后送上海生工测序，获得含小干扰RNA(siRNA)表达框的腺病毒穿梭质粒pSESHUSMCHR2siRNA，其图谱如图1. ?　　图1pSES-HUS-MCHR2siRNA图谱（略） 　　1.2.2pAdeasySESHUSMCHR2siRNA，pAdeasySESHUS载体的构建用CaCl2法将pAdeasy1转化到BJ5183感受态细菌中，pSESHUSMCHR2siRNA，pSESHUS质粒用PmeⅠ酶切线性化，CaCl2法转化到BJeasy感受态细菌．卡那霉素及链霉素抗性培养基筛选阳性克隆，提取质粒．用PacⅠ酶切鉴定质粒并转化DH5α感受态细胞中保存. 　　1.2.3重组腺病毒的包装与病毒滴度测定①包装细胞培养：含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养HEK293细胞，当细胞汇合度达70％～80％ 时转染；②重组腺病毒载体转染HEK293细胞：重组质粒pAdeasySESHUSMCHR2siRNA，pAdeasySESHUS用PacⅠ酶切后回收，按照LipofectamineTM2000说明书转染25 mL瓶中的