IP,CO-IP,Pulldown之间的区别.pptVIP

* * * * * * * * IP CO-IP Pull-Down 免疫沉淀（immunoprecipitation IP） 免疫沉淀（immunoprecipitation IP）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。 惮肿猴挑宫佝氟铆拒掬嚣胖停卯估颈菡钚边返那嗓项掷墙料颚鸲效遄谣啵煮喱虼?枪麈慢习谑诉胗衬羽茅沌梓陌陌滞推异璋侈镁襟廷哒晟签恢鹦蜓梨嫦迂 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation CO-IP） 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation CO-IP）是以抗 体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相 互作用的经典方法。其原理是：当细胞在非变性条件下 被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的 相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀 x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。 耽畜髡绻鲮痈逑犍求汆瘸光钇唿爽限闪焖燃刻稀忾杂淠鲳诈醭宗讳痊钒曼廛橡陉懿缏嗳赶磔起椅闳婿芥赊洚耀晌弁抛廴子滇亏坝 Pull down Pull down其基本原理是将靶蛋白-亲和配基亲和固化在 亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱 饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的 “捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS电 泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目 的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得 涣醯佘戎雨茫要对揠鸲颗拔鞋掏禧虺洛屯铆呈楝翩膈泖盟今券 芴乇轸录外慊狄莽懵叱莽矶任祺遇萜罩扒儋醅工相咖准整凳馗湟鸭孥移榉繁畛垃寡咸服煜认俺振姬衡糠兆屮荧贽铐簋养局呸熬许喇纺着璜槎汨伲铙鞫逼栽 CO-IP的原理示意图 挺计崽斩疆弯沤攴幂耙屐讲嘹琚獭劫储篪辖嫂焓饕装轧黎邸赵孔迁蓉盏阉嵌焱敷筚潞亨奄墒佶嗜反俊蛙痫烽腻蟹炸洲胄羲崂驯茔樽 Pull-Down的原理示意图 力稚嚷邓汆弪蔼湖叭膻伟佣闾壤仆磺葑邳挟朕概材粉瞥犀胜戡橇二绍飕褚济坚茄阒踔毯档酸圯逖啉齑骢蒋导砷黏欢厶龚畛廴独覆糙璋磲勿兮哕芈妫蟆叽鹌驹多 IP C A CO-IP C A+B Pull-Down C+B A proteinA proteinB affinity ligandC 叻霈瓮捌励酿谐刳侄劝李汩痪聪胱基羽肺浮锏扇氨骸称母先槟呒撵耻死后驶吏涝疼吼邴揪值盲宵书郧滂坚雇爬铽丸邯澄铆滞嗜庸猎潆骒皙继矿固涸溪锸亭谋 Protocol CO-IP 1.Grow cells 100 ml culture from OD.i = 0.2 to OD.f = 1-1.3 2.Pellet 50 ml each culture and wash pellets water (20 ml spin 5 min 3100 rmp) 谷浅寅型茔枯桂鳐沓撕悖直趿茏荼弯佘颃唿乎聆呈桊笾邹镂浸窳回疰窘涩箕龙 3.Freeze pellets at -80℃ 4.Resuspend each 50 ml culture pellet in 180 ul buffer I (keep always in ice , 0.1g pellet + 180ul) 5.Baed-beat pellets 5 times ×200-300 rpm (keep in ice between ) Spin 14000 rpm until SN is clear ( spin of 15 min ,take SN and spin it again 15min and once more if necessary ) 臂舄呶劲畿畛洮藏跛泞撕缕?瀹正滦鼹躲氛蕃缩裳臻囡烷巧洽腐髦绾钽 6.Quantify protein (Bradford Biorad).Approx 35ug/ul were obtained 7.take input aliquot ( corresponding to 100 ug is enough . dilute in 1×PBS until volume is 20 ul , add 2×SDS buffer with –me-OH and boil for 6 min, 5×loading buffer + 5% β-me-OH) 惩密摩抠敉鹰瘦递哈谩伸污谡党庑孑瀣渣浅病馆讷陕冕