番茄黑斑病病原菌的鉴定及生物学特性研究.docVIP

番茄黑斑病病原菌的鉴定及生物学特性研究 　　　番茄黑斑病是番茄常见的病害之一，此病是由半知菌亚门番茄链格孢真菌[Alternaria tomato Weber]侵染引起的，链格孢菌是茄科植物中危害较大的病害之一。该病不仅发生在田间，更是采后贮藏过程中的重要病害，可侵染番茄、茄子、辣椒、马铃薯等茄科类蔬菜，主要通过气孔、皮孔、伤口或表皮侵入果实，在适宜的条件下产生大量孢子，对果实造成严重危害[1]。? 　　研究表明，链格孢菌所产生的选择性毒素对植物有致病性，对人体健康也有一定的影响[1]，所以研究链格孢菌的生长特性，探究链格孢菌在不同温度、pH值、光照、碳源和氮源下的菌落长势、直径、菌丝生长速率、菌丝干质量、产孢量的变化，可以探明链格孢菌在不同条件下的生长趋势。? 　　1材料与方法? 　　试验材料? 　　PDA固体培养基：200 g马铃薯，20 g琼脂，20 g葡萄糖，加水补足1 000 mL。PCA固体培养基：g胰蛋白胨，酵母浸粉， g葡萄糖，20 g琼脂，pH值为7，加水补足 1 000 mL。胡萝卜固体培养基：将胡萝卜去皮后称取200 g，20 g琼脂，加水补足1 000 mL。番茄果肉固体培养基：200 g番茄，20 g琼脂，加水补足1 000 mL。V8果汁固体培养基：罐装V8果汁200 mL，20 g琼脂，加水补足1 000 mL。查彼固体培养基：g NaNO3，1 g K2HPO4， KCl， MgSO4， g FeSO4，30 g蔗糖，20 g琼脂，加水补足 1 000 mL。? 　　试验方法? 　　病原菌的分离? 　　根据方仲达的方法[2]，对番茄发病处病原菌进行分离，采用单孢子分离法获得纯化菌株，在PDA培养基上培养后保存备用。生物学特性研究以所获得的纯化菌株tomato为供试菌株。? 　　病原菌形态学鉴定? 　　将供试菌株在PDA培养基上活化，2恒温培养d后，用无菌水制成一定浓度的孢子悬液，同时观察菌落颜色、大小、形状及分生孢子的形态和颜色，从而进行病原菌的鉴定。? 　　生物学特性的研究? 　　温度对菌丝生长和孢子萌发的影响[3]? 　　用打孔器将菌体转移至PDA培养基上，分别置于1、4、15、25、28、30、37、40 的培养箱内，黑暗条件下培养d，用十字交叉法测量菌落的直径，采用小室培养法，将孢子悬液滴于凹玻片上，置于以上条件下培养3、6、1h后，分别检查孢子萌发率。使用棉蓝乳酚油固定孢子悬液，镜检200个孢子，记下萌发的孢子数量，计算萌发率。每个处理3次重复。 　　值对菌丝生长和孢子萌发的影响? 　　用1 mol/L的HCl和NaOH调节PDA培养基的pH值和孢子悬液的pH值为3～12。分别置于2恒温、黑暗条件下和小室恒温培养，观察菌落直径，计算孢子萌发率。? 　　光照条件对菌丝生长和孢子萌发的影响? 　　将接入菌块的PDA培养基和孢子悬浮液，分别在光—暗周期为1h—1h、完全光照和完全黑暗3种处理条件下，于2恒温培养。观察菌落直径，计算孢子萌发率。? 　　不同培养基对菌株生长的影响? 　　分别以PDA、PCA、番茄果肉固体培养基、V8果汁固体培养基和胡萝卜固体培养基用打孔器将菌体转移至固体培养基中心位置，置于2下恒温培养d，用十字交叉法测量菌落的直径。每个样品3次重复，计算平均值。? 　　不同碳源和氮源对菌丝生长和孢子萌发的影响[4]? 　　选取D-木糖、D-果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖等量替换查彼培养基中的碳源，使得各个不同碳源培养基中碳的含量相同；用不加碳源的培养基作为对照。? 　　选取L-谷氨酸、天冬酰胺、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等量替換查彼培养基中的氮源，使得各个不同碳源培养基中氮的含量相同；用不加氮源的培养基作为对照。? 　　将菌块转接到PDA固体平板中央，放置在2恒温培养箱内培养，3、d后用十字交叉法测量菌落的直径，对照平行组计算出平均数，每组试验重复3次。? 　　光照对菌株生长和孢子萌发的影响? 　　将菌块转接到PDA固体培养基内，分别在光—暗周期为1h—1h、完全光照和完全黑暗3种处理条件下，2恒温培养箱内培养；3、d 后测量菌落的直径，对照平行组计算出平均数，每组试验重复3次。? 　　将制备好的孢子悬浮液滴于凹玻片上，分别在光—暗周期为1h—1h、完全光照和完全黑暗3种处理条件下，2联盟的恒温培养箱内培养，6、1h后测定孢子萌发率。? 　　致死温度的确定? 　　吸取1 mL孢子悬液至无菌试管中，分别置于40～6的恒温水浴锅中处理5～20 min后迅速冷却。将处理后的孢子悬液滴于凹玻片上，2小室培养，1h后观察孢子萌发情况，测定孢子萌发率。 2结果与分析? 　　分离菌株的形态学观察? 　　分离纯化后获得5株菌株，分别编号为tomato、tomato、tomato、tomato