3-PCR技术-2011.ppt

第五节 聚合酶链式反应; PCR包括三个基本过程： ①变性： 通过加热使温度升高到94 ℃（86～94 ℃）。在较高温度下，双链DNA变性，解链成单链DNA，为复制提供模板。变性时间：60s ~3分。 ②退火（复性）： 使温度降低到37~65℃，使加入的引物与待扩增的单链DNA互补区特异地结合，为DNA聚合酶合成DNA提供3′―OH。时间：30-60s ;③延伸： 将温度提高到适当水平：70~75℃，通常为72℃，DNA聚合酶以引物3′―OH 为复制起始点，根据碱基互补配对原则，A-T、 G-C，以待扩增区域的核苷酸序列为模板，进行DNA链的延伸，即合成新的DNA分子。时间：1-2分。 上述三个过程组成一个循环周期。每个周期合成的产物又作为下一个周期的模板，如此循环反复，经过n轮循环之后，靶DNA的拷贝数呈2n增长，见下图。;; 如果经过20次循环，理论上，拷贝数将达到220=1048576个分子。由于受多种因素的影响，实际扩增数没有这么多。在指数扩增期可用下列公式计算 Y=A（1+E）n Y为扩增数量，A为模板DNA的最初分子数，E为PCR扩增效率，n为循环次数，其中扩增效率（E）对扩增数量影响较大。 经过一定数量的循环以后，随着产物的指数积累趋于饱和，DNA片段不再呈指数增长，而是进入线性增长期或静止期。此过程称为平台效应。与平台效应有关的因素较多，;以上述PCR基本方法为基础，近几年来，已研究开发了许多不同的PCR新技术，主要有： ① RT-PCR， ② 定量RT-PCR， ③ 快速扩增cDNA末端的PCR， ④ mRNA差异显示的逆转录PCR， ⑤ 代表性差示分析PCR， ⑥ 抑制消减杂交PCR， ⑦ 反向PCR， ⑧ Alu-PCR， ;（二）离子需要及抑制剂需要Mg2+， 抑制剂见表9-1。;（三）保真性 Taq DNA聚合酶无3′→5′校对功能，其保真性见表9-2，;（四）其他耐热DNA聚合酶 1. Tth DNA聚合酶 能有效地逆转录RNA。 2. Vent DNA聚合酶的热稳定性更好, 97.5℃时的半衰期长达130min。具有校对功能，其保真性比Taq DNA聚合酶高5~10倍。 3. Pfu DNA聚合酶具有校对功能, 保真性比Taq DNA聚合酶高12倍, 热稳定性极好, 97.5℃时的半衰期大于3小时。 ;三、PCR引物及设计原则;3、引物之间及引物自身 引物之间不应有4个以上连续互补的碱基，尤其要避免3′端互补重叠以防引物形成二聚体。 引物自身不应存在互补序列，以防形成发夹结构。 4、引物3′端： 不能进行任何修饰（不能有二级结构），尽量避免T碱基，尤其连续2个以上的T碱基。;5、引物5′端，可以进行修饰，;6、避开二级结构区， 选择扩增片段时最好避开二级结构区。7、简并引物：简并引物——碱基序列不同，但有相同碱基数的一组针对某一基因相同区域的寡核苷酸混合物。选择简并引物时，应选择某种生物机体翻译时使用频率较高的密码子，原则上，引物简并度越低越好。降低简并程度的好方法：在高度简并位点用次黄嘌呤（dI）替代，因为dI与任何碱基均可配对。 ;8、引物设计缺陷引起的结果;四、引物的合成与纯化我国有多家生物技术公司可提供这种服务。 五、引物的用量及其计算PCR反应的引物用量一般为10~50 pmol/50 μl体系。Oligo DNA(寡DNA)引物通常以OD260单位来计量。1 OD260单位=33μg 寡 DNA。 引物用量计算公式有2个 Y (p mol) = X/N×105(μg) Y为引物的pmol数，X为OD260 值，N为碱基数。我们用这个公式来计算碱基数为20，OD260为2的引物的p mol 数 ; y (p mol) =2/20×105 =10000 p mol 将它溶于500μl无菌双蒸水中，该溶液的引物浓度为20 p mol/μl, 。 按照PCR反应的引物用量标准（ 10~50 pmol/50 μl ），50μl反应体系，每次反应需取引物0.5~2.5μl。 25μl反应体系需要多少？ 第2个公式： Y (pmol)=X·33×1/MW×106（MW=N×324.5） ;六、 PCR反应条件的优化;3、Mg2+浓度一般为0.5~2.5 mmol/L，过高引起非特异性扩增物增加，过低导致产量下降。现在购买DNA聚合酶时，都带有相应的PCR缓冲液（含Mg2+ ），无须自己配制。 4、引物浓度 一般