复制酶与运动蛋白编码基因的突变对烟草花叶病毒的弱化效应.pdfVIP

中国甜荸(C辑) SCIENCEIN C) 2001年10月 第31卷第5期 CHINA(Series 复制酶与运动蛋白编码基因的突变 对烟草花叶病毒的弱化效应4 杨 恭 邱并生“ 魏军亚 刘广超 叶1吲科学院f数乍物研充所分千病毒与生物丁程”放实验窒，北京100080 摘要 番茄花叶病毒弱毒疫苗K(ToMV—K)的复制酶基因和运动蛋白基因分别具有乳 石和楮石突变的特征为了对这一致弱特征进行扩展研究，用PCR介导的定点突变技 术．对烟草花叶病毒普通株中国分离物(TMV—cv)复制酶基因和运动蛋自基因分别进行 乳石突变(UGA)和楮石突变(UAA)，构建了复制酶单突变体——_TMV—cv阳”，运动蛋白 单突变体——TMv—Cvmp和复制酶与运动蛋白双突变体——吓MV—cv瑚。忡．烟草侵染试 验发现．TMV．Cvmp和TMv—Cv…卅P能侵染枯斑(XanthiNC)和系统(K326)寄主，后者侵 染普通烟K326仅出现少量轻微的花叶症状；子代病毒的电子显徽镜观察、重复接种试 验及其核酸的RNA斑点杂交、RT—PCR扩增与测序结果表晴，TMV—CvmF和 TMV—Cv…唧子代病毒与TMV—Cv的大小和形态基本一致，具有完整和稳定的侵染、 复制和繁殖能力，且其基团组仍保持着突变，而复制酶单突变体TMV—Cv…不能侵染 烟草以上结果表明，复制酶与运动蛋白的乳石突变与赭石突变协同致弱TMV—Cv对 烟草的侵染症状，从而暗示ToMV—K基因组的这种突变模式也可以用于其他植物病毒 的致弱研究． 关键词 烟草花叶病毒 复制酶运动蛋白 弱化效应 突变体 烟草花叶病毒(TMV)是单组分正链RNA病毒，其普通株与番茄花叶病毒(ToMV)的基因组 p30)基因编 全长约为6．4kb，依次由5’非编码区、复制酶(replicase，p126／p183)和运动蛋白(MR PT 7非编码区组成 码区H}结构蛋白基因)、外壳蛋白(c7，6)基因编码区(结构蛋白基因)和3 P1 体外定点诱变烟草花叶病毒外壳蛋白基因，突变病毒可诱导系统侵染的烟草产生温和到 严重的花叶等系统症状””然而，对TMV或ToMv化学或温度诱变的稳定弱毒株系的研究 83的634位氨基酸的突变【“，均导致了病毒的弱化．根据以往的 TMV弱毒株V-36在p126／pl 位氨基酸密码子的无义突变为主，诱导r病毒侵染性的弱化，其运动蛋白(MP)的无义突变对 病毒侵染植物的症状也有一定的弱化作用这种弱化的突变方式是目前在植物病毒弱毒疫苗 2000．09—06收稿200I．04—24收修改稿 +嗣家自然科学基金资助项目(批准号 c“ ’+鞋系人，E—maR：qiubs@sunimIIC 第5期 杨 恭等复制酶与运动蛋白编码基因的突变对烟草花叶病毒的弱化效应417 中发现的特有现象 为了对这一突变模式进行扩展研究，以便为研究植物与病毒之间的相互作用、研制植物病 毒基因T：程疫苗和有效地控制植物病毒病提供可靠的理论依据．我们以烟草花叶病毒普通株 中国分离物(TMV-Cv)的侵染性cDNA(pTMV-Cv)为材料，对其复制酶和／或运动蛋白基因进行 点突变，构建了3个类似TOMV_K基因组突变模式的突变体．本文报道这些突变体的构建、体 外转录与转录产物对枯斑和系统寄主的侵染及对子代病毒的鉴定与分析结果． 1材料与方法 1．1菌种、质粒与试剂 大肠杆菌DH5cc，烟草花叶病毒普通株(中国分离物)侵染性cDNA克隆pTMV-Cv及其5’ 和3’序列亚克隆pTBS，pTBH为本实验室收藏或制备【l”：所用酶均购自TaKaRa(大连)公司；