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实时荧光PCR技术检测过敏原小麦的研究 　　摘要：采用实时荧光ＰＣＲ技术检测过敏原小麦成分。结果表明，采用小麦管家基因ＧＡＧ５６Ｄ和Ｗｘ０１２基因的特异性检测引物和探针进行检测时，２６种样品经实时ＰＣＲ扩增，只有小麦产生阳性的荧光信号，其余样品均不产生荧光信号。灵敏度实验结果表明，该方法对小麦过敏原基因的检测灵敏度较高，可达到１．０ ｍｇ／ｋｇ，符合痕量检测要求。 　　关键词：小麦；实时ＰＣＲ；过敏原检测 　　中图分类号：Ｑ７８９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11405－1053-03 　　 　　Detecting Sensitinogen Wheat in Food by Real-time PCR 　　 　　ＤＯＮＧ Ｗｅｉ１，２，ＣＡＯ Ｊｉ－ｊｕａｎ２，ＺＨＥＮＧ Ｑｉｕ－ｙｕｅ２，ＷＵ Ｙｕａｎ－ｈｕａ１ 　　 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｓｅｎｓｉｔｉｎｏｇｅｎ ｗｈｅａｔ ｉｎ ｆｏｏｄ， ａ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｅ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｈｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ＧＡＧ５６Ｄ ａｎｄ Ｗｘ０１２ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｗｈｅａｔ ｗｉｔｈｉｎ ２６ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ． Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔy ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ １．０ ｍｇ／ｋｇ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｉｎ ｆｏｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ， ａｎｄ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｏｆ ｔｒａｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗｈｅａｔ； ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ； ｓｅｎｓｉｔｉｎｏｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 　　 　　近年来，食物过敏的发生率正继续增加，过敏性疾病发病率在全球呈逐年上升趋势，发达国家超过２０％的人受过敏性疾病的困扰［１］。过敏原又称变态反应原，是指能够使人发生过敏的抗原。美国和欧盟从２００７年开始执行新的食品过敏原标签法规，法规分别要求生产企业明确标明其产品中是否含有８大类和１２种主要的食品过敏原，包括小麦、大豆、花生、芹菜、芥末、芝麻和坚果，畜禽产品，水产品等。根据小麦过敏原以及潜在的过敏免疫机制表明，小麦过敏会影响皮肤、内脏、呼吸道的健康，引起运动激发过敏症、职业哮喘、鼻炎、接触性荨麻疹等［２］。传统的生物活性检测精确度和灵敏度不高，目前采用实时荧光ＰＣＲ技术实现了ＰＣＲ从定性到定量的飞跃，具有实时监测、消除交叉污染、特异性强、定量结果准确等特点［３］。本实验采用实时荧光ＰＣＲ技术，建立了食品中过敏原小麦成分的快速检测方法，为食品过敏原的标签管理、监管、检测提供了可靠的技术支撑。 　　１材料与方法 　　１．１材料 　　实验于２００８年８月在辽宁出入境检验检疫局技术中心实验室进行。实验所用小麦、大麦、燕麦、荞麦、黑麦、白芝麻、糙米、绿豆、玉米、黑大豆、雪豆、泰国香米、花豆、黑小豆、黄豆、豌豆、饭豆、黑大米、胡萝卜、大白菜、韭菜、油菜、花生米、高粱、薏米和小米这２６份样品由大连农业科学院、沈阳农业大学等多家单位提供，或购于大连家乐福超市。ＴａｑMａｎ ＧＥｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ酶预混液购于美国ＡＢＩ公司。用于ＤＮＡ提取的主要试剂ＣＴＡＢ缓冲液配制方法为５５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣＴＡＢ，１ ４００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ， 　　２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，用１０％盐酸调ｐＨ值至８．０，１２１，高压灭菌２０ ｍｉｎ，备用。实验采用的仪器有ＡＢＩ ７３００实时荧光ＰＣＲ仪，核酸蛋白分析仪，台式高速冷冻离心机。 　　１．２方法 　　１．２．１基因组ＤＮＡ的抽提采用宝生物工程有限公司生产的ＤＮＡ提取试剂盒并按其操作说明进行抽提样品的ＤＮＡ。 　　１．２．２ＤＮＡ浓度和纯度的测定 取５ μＬ ＤＮＡ溶液加ｄｄＨ２Ｏ梯度稀释至１ ｍＬ，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测２６０ ｎｍ和２８０ ｎｍ处的吸光值。ＤＮＡ的浓度按照公式Ｃ＝Ａ×Ｎ×５０÷１０００计算获得，式中Ｃ为ＤＮＡ浓度，Ａ为２６０ ｎｍ处的吸光值，Ｎ为核酸稀释倍数。ＯＤ２６０＝１．０表示双链ＤＮＡ浓度为５０ μｇ／ｍＬ。当ＯＤ２６０／ＯＤ２8０比值为１．７～１．９时，适宜于ＰＣＲ扩增。 　　１．２．３引物和探针设计 根据ＮＣＢＩ上已公布的小麦管家基因ＧＡＧ５６Ｄ和Ｗｘ０１２基因的核酸序列，在引物的设计上对小麦管家基因检测引物和探针的退火温度的一致性、ＧＣ含量的相似性等因素进行了充分的考虑，采用ＤＮＡＭＡＮ ８．０软件设计