[药学]人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的分离纯化及真菌RNA提取的研究.pdf

摘要 摘 要 本文主要研究微生物sp.G3g菌产人参皂昔一。一鼠李糖昔酶的分离纯化和真菌中 RNA的提取。 实验结果表明:sp.G3g菌产人参皂昔一a一鼠李糖昔酶的最佳诱导物为人参，最佳浓 度为4%;最佳发酵时间为120小时;用硫酸钱沉淀人参皂昔一a一鼠李糖昔酶的最佳硫 酸钱饱和度为85%0 选用0.025MpH7.2Tris-Hc1缓冲体系下的DEAE-CelluloseDE52分离提纯人参皂 昔一。一鼠李糖昔酶，SDS一聚丙烯酸胺凝胶电泳测定结果为单一的单点，酶蛋白分子量 约为56kDa。人参皂昔一。一鼠李糖普酶在提纯过程中的收率为2.9%;比活力由发酵粗酶 液的14.1U/mg上升为65.6U/mg，提高了4.6倍。 对sp.G3g菌所产人参皂普一“一鼠李糖普酶做蛋白质电印迹以及蛋白质N-端序列测 定，N-端16个氨基酸残基依次为Ser-Thr-Pro-Ala-Asp-Asn-Val-Ser-Gln-Ser-lle-Tyr- Asn-Gln-Asn-Thr,测序结果提取的酶蛋白纯度在97%以上。以这16个氨基酸残基为基 础，在国际互联网蛋白质序列数据库中作蛋白质同源性比较，发现与蛋白质数据库中己 知的蛋白质没有同源性。 sp.G3g菌所产人参皂昔一。一鼠李糖昔酶的最适反应条件的研究表明:酶反应的最佳 底物浓度为1.Omg/ml,最佳酶反应时间为18小时，最适温度为400C，最适pH值为5.0. 对人参皂普一。一鼠李糖若酶的底物水解能力进行的研究表明:提纯酶只水解人参皂 普一。一鼠李糖昔键，酶活力为46.5U/ml，对pNPR和芦丁的酶反应活性都很低，分别为 Lou/ml和0.8U/ml。说明人参皂昔一a一鼠李糖昔酶具有水解人参皂昔Re的C-6位末端 上的。一鼠李糖昔键的酶专一性，是专一性酶。 本文采用异硫氰酸肌和Catrimox-14MT联合变性，酚、氯仿、异戊醇多次抽提，用 异丙醇沉淀RNA，得到了高质量、完整的RNA。提取的RNAOD26)(/OD230=2.16,OD260/OD280= l.82，纯度较好，无杂质污染，均一性比较好。在1g菌丝体中得到的总RNA为1.8mg，得 率为0.18%。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳28SRNA条带的亮度接近18SRNA条带亮度的2倍， 表明总RNA分子完整，降解较少。 关键词:人参皂昔一a一鼠李糖昔酶，人参皂昔Re，人参皂昔Rgi,RNA提取 Absrtact Abstract Inthispaper,ginsenoside-a-rhanmosidasewaspuredandRNArfomfungiwasisolated. Theresultshowsthattheoptimuminducementisginsenandwiththeconcentrationof 4%.Theoptimumculturetimeofsp.G3gis120h. Then,ginsenoside-a-rhamnosidasewaspuredusingDEAE-cellulosecolumn.Thepure enzymepurityandmolecularweightof theginsenoside-a-rharnnosidasefrom microorganismssp.G3gweredeterminedusingSDS-polyacrylamidegelelectrophoresisto obtainonespotandM.VJ.is56kDa.Inthepuringprocess,theyieldofginsenoside-a- rhamnosidaseis2.9%,andtheactivityincreasedfrom14.1U/mgto65.6U/mg. Additionally,theaminoacidssequenceoftheginsenoside-cL-rharnnosidasefrom microorganismssp.G3gwasSer-Thr-Pro-Ala-Asp-Asn-Val-Ser-Gln-Ser-Ile-Tyr-Asn- Gln-Asn-Thr.Thesequencewasdi