形态学实验技术PPT.ppt

形态学实验技术;组织切片制作技术 石蜡切片常规染色技术 石蜡切片特殊染色技术 免疫组织（细胞）化学技术 免疫细胞化学的理论基础 免疫荧光细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术 亲和免疫细胞化学技术 ;电子显微镜技术（electron microscope, EM） 1. 透射电子显微镜 2. 扫描电子显微镜 3.电镜技术与生物医学超微结构 4. 细胞超微结构与超微结构病理 ;第一章 组织切片制作技术; 组织切片技术: 组织的取材、固定、脱水、透明、 浸蜡、包埋、切片及染色等。 ; 一、取材（ tisssue processing） 1 材料新鲜：活检组织离体后立即固定，最迟不能高于30分钟。 2 取材部位及切面：纵切或横切往往是显示组织结构明晰的关键。掌握正确的取材部位就必须熟悉机体的组织结构和解剖特点，原则上应在病变与正常组织的交界处取材，避开坏死出血区。 ; 3.勿使组织受挤压：取材??剪应锋利，切开时取材刀严禁来回挫动，以避免组织结构变形、细胞破碎。 4.防止变形：固定后的组织或多或少会产生收缩现象。 5.组织块力求小而薄：切块的大小、厚度及质地决定了固定的效果，一般情况下，取材大小为2×1cm，厚度为2－4mm。 ; 二、固定（fixation） 固定是将某些化学试剂（固定液）渗透到需要保存或制作切片的脏器或组织、细胞中，使其所含物质尽量保持在生活状态时的形态结构和位置。;固定的目的： 1.迅速防止组织细胞的死后变化,防止自溶与腐败使之尽量保持生前的形态结构。 2.使细胞内的蛋白质、糖、脂肪、酶等成分变为不溶性物质，以保持其原有形态及特定位置。 ;3.能将细胞的半液体状变成半固体状，使组织变硬以利切片。 4.可使组织内的各种成分产生不同的折光率。 5.某些固定液可起助染作用而增进染色。 ;固定方法 浸泡固定 注射、灌注固定 微波固定 蒸汽固定 ;常用的固定剂 单纯性固定剂：甲醛（福尔马林 formalin） 乙醇；乙酸。 混合固定剂：中性甲醛pH 7.0（甲醛、磷酸缓冲液）；A-F液 （甲醛、酒精） ;三、脱水（dehydration） 将组织内的水分用某些化学试剂置换出来的过程。 脱水的目的 标本经固定和水洗后，组织内有大量水份，不能与二甲苯混溶，因此必须脱水。;常用的脱水剂和脱水方法 脱水剂有：乙醇、丙酮等 80％ 酒精 30 分钟 95％ 酒精 1－2小时 95％ 酒精 1－2小时 100％酒精 1－2小时 100％酒精 1－2小时 ; 四、透明（clearing） 为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后必须经过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，而达到石蜡浸入组织块的目的。此时因组织块的水分被二甲苯取代，其折射指数接近于组织蛋白的折光指数，组织块变得透亮。因此透明是石蜡包埋前的一个特定步骤。 透明的目的：便于浸蜡、包埋。透明剂即能与脱水剂相混溶，又能与包埋剂（石蜡）相混溶，起到桥梁作用。; 大多数脱水剂不能和包埋剂（石蜡）混溶，故必须通过透明剂置换出脱水剂后才能进行后续程序。 常用的透明剂 二甲苯：为最常用的透明剂，有毒、易燃、易挥发；沸点1380C-1400C,长期接触对粘膜有刺激作用。 氯仿:易挥发微溶于水，易溶于醇、醚、苯等。它比二甲苯透明力差，但不宜使组织变脆，是大块组织的良好透明剂 ;常用的透明方法 二甲苯透明法（常用）：彻底脱水的组织块 二甲苯1 二甲苯2，此二步总的时间不超过40分钟。 氯仿透明法：彻底脱水的组织块按 3：1氯仿、纯酒精混合液1小时 氯仿1 - 2小时 1：1氯仿石蜡混合液1小时。;五、浸蜡与包埋 浸蜡(paraffin infiltrating)和包埋(embedding) 是指标本经过前期处理后，再置于支持物中，使支持物透入组织内部，并将组织埋入、包裹的过程。常用的支持物有明胶、石蜡、火棉胶、树脂、炭蜡等，他们既是浸透剂又是包埋剂。其中最常用的是石蜡。; 浸蜡的方法 此法应在560C－620C的温箱内进行，液状石蜡的量应为标本的25－30倍。 方法：透明后的组织 520C－540C（软蜡）1小时 540C－560C石蜡1小时 580C－600C（硬蜡）1小时 540C－560C石蜡进行包埋 ;第三节 组织切片;5.切片：要求质量，左手毛笔，右手眼科镊，转速均匀。 6.展片、捞片：常用水温为450C左右，组织膜与玻片附着的位置为，右手持片，玻片的左2／3正中。 7.烘片：烘烤箱的温度为630C以