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骆驼刺ISSR-PCR反应体系的建立 　　摘要：用ＣＴＡＢ法提取叶片ＤＮＡ，然后通过单因素实验，研究了Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶浓度、ｄＮＴＰｓ浓度、引物浓度和Ｍｇ２＋浓度４种因素对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的影响，建立了适合于骆驼刺的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，其为２５ μＬ总体积中含1×ＰＣＲ反应缓冲液、１．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、０．６ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、０．６ μｍｏｌ／Ｌ引物、１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２。 　　关键词：骆驼刺；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ；单因素实验 　　中图分类号：Ｑ９４９．７５１．９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11405－1063-03 　　 　　Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ａｌｈａｇｉ ｓｐａｒｓｉｆｏｌｉａ Ｓｈａｐ． ＩＳＳＲ－ＰＣＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ 　　 　　ＺＨＡＯ Ｘｉｎ１，ＫＡＩＳＡ Ｓｕｌａｉｍａｎ２，ＺＨＵ Ｇｕｏ－ｑｉａｎｇ２，ＡＹＩ Ｂｉｅｋｅ２ 　　 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ａｌｈａｇｉ ｓｐａｒｓｉｆｏｌｉａ ｌｅａｆ ｂｙ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ， ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｏｕｒ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｃｌｕｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄＮＴＰｓ， ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｍｇ２＋ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｌ×ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ， １．５ Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， ０．６ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ， ０．６ μｍｏｌ／Ｌ ｐｒｉｍｅｒ， １．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２ ｉｎ ｔｈｅ ２５ μL ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｌｈａｇｉ ｓｐａｒｓｉｆｏｌｉａ Ｓｈａｐ．； ＩＳＳＲ－ＰＣＲ； ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ 　　 　　骆驼刺为豆科蝶形花亚科骆驼刺属的半灌木，是新疆地区良好的饲草饲料及蜜源植物。骆驼刺茎部分泌的刺糖，具有收敛、止泻、止痛之功，是维吾尔族习用药之一，主治腹痛、腹泻、痢疾等症，其种子亦入药。骆驼刺作为蜜糖植物发展前景广阔，开展骆驼刺资源研究具有深远意义。 　　简单序列重复区间ＤＮＡ标记技术，结合了ＳＳＲ和ＲＡＰＤ两种技术的优点，具有模板需要量少，多态性丰富、成本低、操作简单、稳定性高等优点，而较之ＡＦＬＰ技术又具技术要求较低的特点。近年来ＩＳＳＲ ＤＮＡ标记技术已广泛应用于品种鉴定、种质资源和遗传多样性研究等领域。本研究采用单因素实验法，对体系中的各因素进行筛选，建立了骆驼刺植物的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，为研究骆驼刺的遗传多样性奠定了基础。 　　１材料与方法 　　１．１材料 　　将骆驼刺种子播于穴盘萌发幼苗，待幼苗长出两片真叶时取样，液氮冷冻后于－８０保存，待用。骆驼刺种子由新疆中药民族药研究所凯撒 　　１．２试剂 　　实验所用Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ均购自宝生物工程有限公司。ＩＳＳＲ引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　１．３方法 　　１．３．１基因组ＤＮＡ的提取及ＤＮＡ质量检测采用改良的ＣＴＡＢ微量法提取基因组总ＤＮＡ［１］，用 　　０．８％的琼脂糖凝胶电泳检测ＤＮＡ质量，ＤＮＡ的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定，并将ＤＮＡ浓度稀释到２０ ｎｇ／μＬ，于－２０保存备用。 　　１．３．２ＩＳＳＲ引物从加拿大哥伦比亚大学提供的ＩＳＳＲ引物 中选择适宜进行植物ＩＳＳＲ分析的引物，选定序列８ＲＣ用于ＩＳＳＲ分析体系的建立与优化。 　　１．３．３ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增与体系优化设计在骆驼刺ＩＳＳＲ分析体系的初步建立中，ＰＣＲ反应体积为２５ μＬ，内含ｌ×ＰＣＲ反应缓冲液、２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣl２、０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰs、０．３ μｍｏｌ／Ｌ 引物、１．０Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶与５０ ｎｇ总ＤＮＡ。扩增程序为９４、３ ｍｉｎ；９４、４５ s，５４、１ ｍｉｎ，７２、２ ｍｉｎ，３５次循环；７２、７ ｍｉｎ。从引物浓度、ｄＮＴＰｓ浓度、Ｍｇ２＋浓度和Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶浓度等方面对骆驼刺ＩＳＳＲ分析体系进行优化。各因素水平见表１。 　　１．３．４ＰＣＲ扩增产物的检测用含ＥＢ的１．５％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。在凝胶成像系统上观察电泳结果并记录凝胶图像。 　　２结果与分析 　　２．１