[基础医学]20111129 文献.pptVIP

Hepatitis B Virus Replication Induces Methylation of both Host and Viral DNA PerumalVivekanandan,1 HubertDarius-JDaniel,1 RajeshKannangai,1 FranciscoMartinez-Murillo,2 andMichaelTorbenson 1* 文献背景 1、全球估计有超过40亿人感染HBV，HBV感染成为一个主要的发病率和死亡率，尤其是HBV导致的肝癌（HCC）. 2、肝癌形成是由各种综合因素导致的，包括病毒整合、肝硬化形成和X蛋白的作用，其中病毒的复制具有很强的致癌作用。 3、最近的研究表明HBV DNA的表观遗传修饰（epigenetic modifications）是一种控制病毒基因表达的一种新型机制。 HBV形态与基因结构 嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)正肝DNA病毒属 电镜：3种形态 1、HBV基因组长约3.2kb ，为部分双链环状DNA，长链即负链(L-)，短链即正链（S+） 2、HBV有4个读码框架，基因组分别为S、C、P、X，均由长链DNA编码，分别编码不同的抗原多肽 HBsAg HBcAg HBeAg HBxAg HBV复制过程 cccDNA 形成的途径目前认为: HBV 侵入肝细胞后脱去包膜, HBV DNA 进入肝细胞核内, 在 HBV DNA 聚合酶的作用下, 以单核苷酸填补 HBV DNA 正链的缺口, 从而形成完整的双链环状DNA。然后在拓扑异物酸作用下形成超螺旋结构，又称共价闭合环状 DNA（cccDNA）。 HBV DNA 复制则以 cccDNA 为模板 , 先复制出前基因组RNA, 再以前基因组 RNA 反转录负链 DNA, 又合成正链 DNA,变成双链环状 DNA, 最后形成子代 DNA, 子代 DNA保留了母代 DNA 的完整准确的序列。 DNA甲基转移酶基因（DNMTs） DNA 甲基化是真核生物基因表达调控的一种方式， 是一种酶介导的化学修饰过程.DNA甲基化是由 DNA甲基转移酶( DNA methyltransferase) 催化并维持和调控的 。在甲基转移酶的催化下， DNA 的 CpG 二核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶DNA 甲基转移酶家族包括 DNMT1、DNMT2、DNMT3A 和DNMT3B。DNMT1 负责保持甲基化， 主要作用于半甲基化的底物， 存在于几乎所有体细胞中。 在增殖细胞中高表达 DNMT3A 和 DNMT3B 则被认为是参与催化 DNA 的从头甲基化， 在胚胎干细胞和早期胚胎中高度表达， 在正常体细胞表达低， 而在各种癌细胞中高表达 目的：探讨HBV感染导致宿主和病毒DNA甲基化机制及其相互关系。 材料和方法 1、HBV DNA感染细胞 ⑴ 用和 Paran 等研究中相类似的实验方法对其进行感染,其中要利用二甲基亚砜( DMSO)来使病毒直接感染细胞。 ⑵ HepG2和Huh7 细胞置入含有 10%胎牛血清的2% DMSO 高糖Dulbecco’s培养基内培养直至其铺满标准24孔板(3天)，细胞铺满后, 用 2% 的 DMSO 处理 ，到第6天, 与总数为 8 log 10拷贝的完整 HBV 颗粒在 37 ℃下共同培养14h。 ⑶感染完成后充分洗脱，用含有 10%胎牛血清的2% DMSO 高糖Dulbecco’s培养基铺板，分别于培养 2、 4、 6 和 15 d 时收集细胞并抽提 DNMT mRNA。 材料和方法 2、抽提DNMT mRNA，逆转录为cDNA，用real-time PCR 检测 DNMT引物见表1 PCR cycling conditions were 10min at95°C followed by 40 cycles of 95°C for 20s,55°C for 25s,and 72°C for 25s. 特异性由熔化曲线分析和琼脂糖凝胶电泳保证。 3、HBV和DNMTs的共转染到Huh7细胞系 ⑴HBV＋空载体 ⑵HBV＋甲基化DNMT3a ⑴HBV＋DNMT3a ⑵甲基化HBV 每次转染均做一式三份，72时后收集悬浮颗粒和细胞 材料和方法 4、HBV蛋白质的检测 ELISAs 检测 HBsAg and HBeAg 5、HBV RNA的检测 抽提RNA，逆转录为cDNA，用real-time PCR 检测 HBV引物见表1 HBV pregenomic RNA HBV pr