胚胎的保存.pptVIP

（七）、胚胎的保存 1、异种活体保存 2、常温保存 3、低温保存 4、超低温保存 1）、常规的慢速冷冻 尽管低温生物学有了许多发展，但新的胚胎冷冻方法却很少用于生产实践。目前，大多数的哺乳动物胚胎采用传统的慢速冷冻方法冷冻保存，使用渗透较快的低温保护剂，缓慢的冷却速度和比较快的解冻速度。传统的慢速冷冻方法分为以下几步：1）室温下胚胎置于小分子量可渗低温保护溶液中（如乙二醇、甘油、二甲基亚枫或丙二醇），且在胚胎和冷冻保护液之间达到平衡；2）一般在-5℃～-7℃植冰；3）可控的、缓慢降温（0.33～1.0℃／分）；4）降温到-30℃或-70℃时，投入液氮中保存；5）快速解冻；6）在培养或移植前，在室温下除去低温保护剂，为保持细胞的正常生理功能。每一步冷冻方法都是至关重要的。 2）、玻璃化冷冻 玻璃化冷冻定义为在冷冻液处于完全玻璃化状态下冷冻保存细胞，组织或器官（Rall，1985）。为在一定冷冻速度下形成玻璃化（直接投入液氮，-2500℃/分）。需要使用高浓度的可渗低温保护剂，然而，浓度过高会对细胞有毒害作用。从理论上讲，如果要以-1500℃/分的速率进行降温，那么，1.5M的任何低温保护剂都可以形成玻璃化，但这需要昂贵而复杂的仪器。近几年，人们通过减少冷冻液的体积和冷冻液与冷冻和解冻直接接触的方法来提高冷冻和解冻速度，从而最大限度的减少冷冻液对胚胎的损害，其中OPS法（Vajta，1998a；1998b）和cryoloop（Arav，1997；Martino，1996；Papis，2000）法获得较好的效果。 3）、胚胎的解冻 a、常规冷冻法的解冻方法 b、玻璃化冷冻的解冻方法 （八）胚胎的移植：手术和非手术法 1、 手术法移植（各种家畜和实验动物） 在受体腹部作一切口，找到排卵一侧的卵巢并观察黄体发育情况，然后用注射器或移植管将含有胚胎的培养液或冲冼液注入到子宫角内或输卵管内。 ??? 1 、受体牛在发情后6—8天之间均可进行移植（发情之时定为0小时）。移植前对受体牛进行直肠触摸，检查黄体是否合格。合格者用于移植。 ??? 2、 在移植之前必须先进行尾椎硬膜外麻醉 ，擦拭外阴部。 ??? 3、 对照供体牛采胚记录表和合格受体的发情记录，合理地搭配受体和胚胎。 ??? 4、 解冻胚胎。 ??? 5、 重新将胚胎装入0.25ml塑料细管（直接解冻移植法不需要重新装管）。 ??? 6、 细管装入移植枪。 ??? 7、 把装有细管的移植枪套上硬外套，用塑料环卡紧，再套上软外套。 ??? 8、 将胚胎移植到受体黄体侧的子宫角大弯处。 ??? 9、 做好受体移植记录。 牛非手术法胚胎移植操作步骤 ??1、 在移植后70—90天对受体牛进行妊娠检查，对已妊娠的受体要加强饲养管理，避免应激反应。 ??2、 妊娠受体在产前3个月要补充足量的维生素、微量元素，适当限制能量摄入，既要保证胎儿的正常发育，又要避免难产。 ??? 3、妊娠的受体牛的饲养管理 四、ET的实际效果和影响妊娠率的因素 （一）、 ET的实际效果 1、胚胎来源 1）排卵率 2）回收率 3）受精率 2、胚胎冷冻和胚胎分割的应用 （二）、影响妊娠率的因素　 1、胚胎因素 2、母体因素 3、其他因素 五、ET存在的主要问题 1、胚胎来源有限 2、缺乏熟练的技术人员 3、胚胎冷冻技术不完善 4、费用高、要求高 5、手术法容易出现粘连的问题 2、发展历史（续） 20世纪60年代初至20世纪80年代中期，人们以家兔、小鼠和大鼠等为实验材料，进行了大量基础研究，在精子获能机理和获能方法方面取得很大进展。精子由最初在同种或异种雌性生殖道孵育获能，发展到用子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等在体外培养获能，最后用化学成分明确的溶液培养获能。同时，通过射出精子和附睾精子获能效果的比较研究，人们发现射出精液中含有去能因子，并认识到获能的实质是去除精子表面的去能因子。这些理论和方法上的成就，推动了体外受精技术的发展，试管小鼠(Whittingham，1968)、大鼠(Toyoda和Chang，1974)、婴儿(Steptoe和Edwards，1978)、牛(Brackett等，1982)、山羊(Hamda，1985)、绵羊(Hanada，1985)和猪(Chang等，1986)等相继出生。 * * 4、超低温保存 胚胎装管图 山　羊　胚　胎　移　植 2、牛胚 胎非手术 移 植 示 意 图 六、胚胎移植的发展前景（以牛、羊为例） 1、牛胚胎移植技术应用前景 因为牛的经济价值高、单胎、繁殖周期长、常年发情，所以采用胚胎移植技术生产优质奶牛、肉牛，正适于当今国内奶牛、肉牛生产旺盛需求，其更具广阔发展空