[工程科技]第4章 蛋白质的共价结构.ppt

蛋白质存在于所有生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，参与了几乎所有的生命活动过程。 蛋白质多由一条或一条以上的肽链组成 肌红蛋白 血红蛋白 蛋白质一级结构：以肽键连接而成的肽链中的氨基酸的排列顺序。 蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。 什么是Pr的一级结构？ 蛋白质一级结构的测定 HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His- Leu-Val- Glu- Ala- Leu- Tyr –Leu -Val-Cys-Gly Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOH B链 1 5 7 10 15 19 20 21 25 30 HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH 1 5 10 20 15 A链 7 11 6 21 S S S S 1953，牛胰岛素是第一个被测定一级结构的蛋白质分子。 —S————S—— NH2 COOH 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序 专一性裂解 末端氨基酸测定 二硫键拆开 纯蛋白质,末端测定确定肽链数目 蛋白质顺序测 定基本战略前提：样品是均一的，已知相对分子量  1、肽链末端分析 （1）N-末端测定 A、二硝基氟苯法(Sanger 法) DNP-氨基酸为黄色。乙醚提取。通过测定可知N端氨基酸为何。根据DNP-氨基酸的数目可以确定蛋白质有几条肽链。 N端为仲胺，不宜用此法，如末端为脯氨酸时，不宜用此法。 B、苯异硫氰法 Edman法，PTH法 PTC氨基酸不稳定，极易分解， 当成环为PTH氨基酸时稳定。 Edman 降解法 苯异硫氰酸(酯)法 Edman法，PTH法 乙酸乙酯抽提，然后鉴定。 优点： PTH-氨基酸抽提后的剩余肽链，可以重复使用该法，从N-端逐一测定氨基酸的排列顺序。从而测定整个片段的氨基酸顺序。 氨基酸顺序自动分析仪根据此原理设计。 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1?10-9mol。 C、二甲基氨基萘磺酰氯法 D、氨肽酶法 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 NH2 ---aa---aa---aa---aa……. 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。 （2）C—末端测定 A、肼解法 肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 C端氨基酸与2,4-二硝基氟苯反应，所得物DNP氨基酸用乙醚提取，进行测定。 该法弊端： 天冬氨酸、谷氨酰胺，半胱氨酸被破坏； 精氨酸变成鸟氨酸。 B、羧肽酶法 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除脯氨酸,精氨酸和赖氨酸以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序 专一性裂解 末端氨基酸测定 二硫键拆开 纯蛋白质 2、二硫键的拆开和肽链的分离 A、二硫键的还原 B、二硫键的氧化 二硫键拆分后得到肽链，可以通过纸层析、离子交换柱层析或电泳的方法进行分离。 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序 专一性裂解 末端氨基酸测定 二硫键拆开 纯蛋白质 3、肽链的部分水解和肽段的分离 多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。 肽链部分水解的要求：选择性强、裂点少， 分为：化学法、酶解法。 A：化学法 化学法：溴化氰裂解法和酸水解法 溴化氰水解法：它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 酸水解法