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第六章 细菌的检查方法与防治原则 遵义医学院珠海校区 主讲：孙万邦 The Preventive Principle and Examine Methods of Bacteria 问题 1 、在进行细菌学检查时对标本的采集与送检的注意事项有哪些? 2 、细菌感染病原学检查方法有哪些? 3 、何谓疫苗、类毒素和抗毒素，死疫苗与活疫苗各有何优缺点? 4 、比较人工主动免疫与人工被动免疫的主要区别。 ? 第一节 细菌学诊断  一、标本的采集原则 1．取样部位 2．无菌操作 3．妥善处理 4、及时送检 二、致病菌检查程序 血清学诊断（双份血清） 采集标本 直接形态学检查 细菌分离培养 特异性抗体检测 凝集反应 沉淀反应 中和试验 免疫标记技术 等 细菌快速诊断 PCR 核酸杂交 DNA指纹 DNA芯片技术 形态学检查 生化反应 抗原检测 药敏试验 动物实验等 (一)检查致病菌 1. 涂片镜检 来自正确部位且形态染色性上具有特征 的病原菌,进行直接涂片镜检后均有初步 诊断价值。 要确诊致病菌需要作进一步鉴定。有些 不易进行人工培养或培养时间较长的细 菌,只能通过染色镜检并结合临床症状进 行诊断。 2. 离分培养  用固体琼脂平板进行分区划线,分离出单个菌落后再进行纯培养。原则上所有标本均应进行分离培养,以获得纯培养。采用需氧培养法、高渗培养法和厌氧培养法。 3. 生化检测 不同致病菌有不同酶进行分解代谢, 代谢产物不同。 生化反应有助于鉴别细菌。例如,肠道菌种类繁多,形态、染色性和菌落等较为相似,但肠道菌可根据其分解糖和蛋白质的差异进行区别。 4. 抗原检查 用已知的特异性抗体检查鉴定未知标本分离的纯种细菌。方法:玻片凝集试验, 免疫荧光、协同凝集、对流免疫电泳、酶联免疫吸附试验等试验可快速、灵敏地检出标本中微量致病菌抗原,有助于病原菌的确定 5. 动物试验 用于某些疑难的、新的病原菌的分离鉴定、测定菌株的产毒性和科学研究。常用的实验动物有小鼠、豚鼠和家兔等。接种途径有皮内、皮下、腹腔、肌肉、静脉、脑内和灌胃等。 6. 药物敏感试验 药敏试验方法有: 纸碟法、打孔法、小杯法和试管法等多种,以纸碟法和试管稀释法较常用。指导临床用药,及时治疗和控制耐药菌感染意义较大。 (二)检测致病菌成分 1. 检查抗原 常用的方法有:免疫荧光、协同凝集、 ELISA、间接血凝、乳胶凝集及对流免疫电泳等。其原理是用已知的特异抗体检测未知的抗原。例如,脑膜炎奈瑟菌感染引起的急性化脓性脑膜炎可用特异抗体作对流免疫电泳检查其脑脊液中相应的抗原,1 h内可出结果。 2. 检测核酸 ( 1 )核酸杂交( nucleotide hybridization) 原理是应用已知序列的核酸单链作为探针( probe),探针事先已用放射性同位素,如32 P或非放射性物质,如生物素、地高辛或辣根过氧化物酶等标记。 在一定条件下,按照碱基互补原则与处理后的标本中未知的单链核酸杂交,然后通过探针上标记物的反应信号,得知标本中有无特异序列与探针结合。 ( 2 )多聚酶链反应( polymerase chain reaction,PCR) 是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的无细胞分子克隆技术。在体外数小时内可将标本中含有的某段基因序列扩增上百万个同一基因片段。 ( 3 ) DNA指纹( fingerprinting)或图谱( profile) 包括细菌染色体DNA或质粒DNA指纹或图谱。主要用于追踪鉴定传染源及流行病学调查等方面的研究。 ( 4 ) DNA芯片( DNA chip)技术 原理是,先合成上千万个特异的寡核苷酸探针,并有序地点布在硅片及玻片等固相支持物上组成微点阵( microarray),即DNA芯片( DNA chip);随后抽提待测样品中的mRNA,用荧光染色标记后与芯片上的探针进行杂交。 第二节 血清学诊断 一、抗体效价及其判定 不同的病原体,不同的病程,初次感染和再次感染,抗体产生的量均可不同,并存在动态变化。在血清学试验中,可先将血清稀释成不同的比例,再与一定量的已知抗原相互作用,最后测出抗体的含量。 抗体效价(滴度,titer)是以明显观察到抗原抗体反应出现的最高血清稀释度为单位。 二、常用血清学诊断方法的种类 表7 -1 血清学试验的种类与应用 种 类 应 用 举 例 凝集反应 直接凝集试验肥达试验(诊断伤寒及副伤寒) 外斐试验(诊断立克次体病)