[理学]52多聚酶链式反应扩增DNA.ppt

（一） 、PCR技术的原理 利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。 体外DNA复制的条件： 四种脱氧核苷酸、耐高温的聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。 复制的方向：子链的5′端向 3′端延伸。 （二）、PCR的反应过程 反应周期 （二）、PCR的反应过程 以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率 （二）、PCR的反应过程 （1）变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。 （2）复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 （1）PCR循环--变性 （1）PCR循环--变性 （1）PCR循环--变性 （2）PCR循环—复性 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 三、实验步骤： 四、操作提示： 操作提示 1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。 2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。 五、结果分析与评价 1、原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰(图5-11)。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。 注意事项：详见操作提示 六、课题延伸 1、PCR优点： 2、PCR技术的应用P58 练习 (课堂检测) 1、DNA单链的________末端为3′端, ________末端为5′端,在DNA复制时,引物从模板链的___端配对结合.在___________酶的作用下,从引物的____端,使子链向下延伸. 2每次循环可以分为______________________这三个过程,对应温度分别为__________________. 练习 (教材P63) 1、一个DNA片段经过30次循环后能形成________个这样的片段. 2、依据DNA吸收紫外光的情况,用紫外分光光度计测得 DNA=_____________________________ 五、结果分析与评价 DNA 含量的测定：稀释→对照调零→ 测定→计算（公式见P63） 波长260nm处读数 蒸馏水做对照 50倍 实验结果与分析 DNA含量(ug/mI)=50 ×（260nm的读数）× 稀释倍数 原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作 PCR技术与体内DNA复制的区别： 1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要； 2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而其他生物体内的聚合酶在高温时会变性； 3. PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。 磷酸基团 羟基 羟基 DNA聚合 3/ 变性、复性、延伸 95℃、55 ℃ 、72 ℃ 90℃以上、50℃左右 、72 ℃左右 230 50 x(260nm的读数)x稀释倍数 练习巩固 1、关于PCR技术的应用，错误的一项是 A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定 B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学 C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘ D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定 2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？ 3、PCR技术最突出的优点是 A 原理简单 B 原料易找 C TaqDNA聚合酶有耐热性 D 快速、高效、灵活、易于操作 子链的5′端向 3′端延伸 4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是 A 反复洗涤 B 不怕外源DNA污染 C 高压灭菌 D 在-20 ℃储存 移液器 返回 * DNA多聚酶链式反应扩增DNA片断 课题2 1、多聚酶链式反应的概念 一 、课题背景 2、多聚酶链式反应的应用： 的诊断、 、 、 和DNA 等各方面。 遗传疾病 刑侦破案 古生物学 基因克隆 序列测定 1、DNA分子的组成成分和结构 DNA 分子的基本组成单位是 .