研究生---基因工程技术.pptVIP

 分：目的基因的获取、载体的选择 切：限制性内切酶的应用 接：用连接酶将目的基因和载体连接重组体 转：将重组体导入到受体细胞 筛：采用适当的方法筛选出含有目的基因的阳性克隆 表：目的基因在受体细胞表达，获取表达产物 基因工程实验特点及要求 1. 微量操作 2. 连续性操作 3. 低温操作 4. 防止污染（试剂污染、细菌污染） 5. 实验物品切忌乱扔乱丢 6. 认真写好实验纪录 第一次实验: 质粒DNA大量制备、浓度及纯度分析 第二次实验： RT-PCR 第三次实验：DNA限制性内切酶消化、电泳、片段回收、重组连接 第四次实验：重组质粒的转化、Southern杂交演示 第五次实验：重组质粒的鉴定（质粒DNA小量快速制备、酶切、电泳）、考试 实验一 质粒DNA大量制备、浓度及纯度分析 目的：获得高浓度、高纯度的质粒DNA。为酶切和基因转染作准备。 基本步骤： 细菌的生长和质粒的扩增: 将表达质粒DNA的活细菌进行大量培养。 细菌的采集和裂解,抽提质粒DNA：碱变性法提质粒 ； 质粒DNA的提纯:除蛋白质、RNA和与质粒DNA分子量相近的断裂DNA 。 碱变性抽提质粒DNA原理： 利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同，变性和复性的差异。 在pH=12.6的NaOH-SDS环境下，质粒DNA与染色体DNA的氢键均破坏，但是染色体DNA断裂成线状，而质粒DNA仍为闭环，且相互缠绕没有分开。当pH调整到7.0，质粒DNA复性存在溶液中，而染色体DNA不能复性与变性的蛋白质、SDS相互缠绕形成沉淀，经离心被分离。 质粒DNA的纯化： 蛋白质的清除：蛋白质的变性剂——酚和氯仿. RNA的清除：RNA酶消化；LiCl沉淀;层析。 与质粒分子量相近的线状断裂的DNA分子的清除：等体积1.6mol/L NaCl , 13%PEG; CsCl梯度超速离心等。 Sepharose 2B柱层析法（琼脂糖凝胶柱） 利用分子筛效应，分子量大的分子不能进入凝胶颗粒网孔，顺着颗粒间隙先流出，分子量小的分子进入凝胶颗粒孔经内，流程长，后流出来。质粒DNA分子量大于RNA，故先洗脱下来。 LiCl沉淀法：Li+可与RNA结合，形成锂盐沉淀，而DNA不与锂结合，故经离心可将二者分离。 聚乙二醇沉淀法：只沉淀环状DNA 操作步骤: 收集细菌 DNA片段的琼脂糖凝胶电泳分离 原理　以琼脂糖为电泳支持物，DNA因分子大小、形状、构象不同，在相同的电泳条件下，因迁移率不同而被分离。DNA可与荧光染料——溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯照射下呈桔红色荧光条带。 DNA可与荧光染料——Goldview结合，在紫外灯照射下呈绿色荧光条带。 。 琼脂糖凝胶电泳的优点：操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理；琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98-99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电泳小，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；凝胶透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用字外监测及定量测定；区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定，制成干膜可长期保存。 DNA的琼脂糖凝胶电泳影响因素： 1. 核酸分子大小：迁移率与分子量的对数成反比，但当20kb时，迁移率不再依赖于分子大小； 2. 核酸构型:分子量相同的情况下，共价闭环DNA直线DNA开环环状DNA 3.与凝胶浓度关系:一定大小的DNA在不同凝胶浓度中迁移率不同； 4.其它影响因素：缓冲液的成分、离子强度及电压（5v/cm）等 DNA浓度及纯度分析: 紫外分光光度法 双链DNA: 1OD260nm= 50ug/ml 单链DNA或RNA: 1OD260nm= 40ug/ml 核苷酸: 1OD260nm= 20ug/ml 结果分析： * 基因工程技术 (Genetic engineering) 基因工程的基本程序：分、切、接、转、筛、表 G CCTAG G CCTAG G CCTAG G CCTAG 分 切 接 转 筛 表 基因工程实验安排 质粒 （plasmid）：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 溶菌酶 GET 破壁 SDS-NaOH pH=12.6 碱变性 KAc pH=4.8 质粒DNA完全复性 染色体DNA不能复性 离心 上清: 质粒,小分子RNA, 少量蛋白质 沉淀: 染色体DNA, 大分子RNA , SDS-蛋白质复合物 取上清, 加等体积异丙醇沉淀DNA(缩小体积) 离心 沉淀溶于TE 等体积LiCl 沉淀RNA 离心 加等体积酚 氯仿异戊醇 去杂蛋白 离心,取上 层水相 酚氯仿异戊醇 重复一次 离心,取上层水相 2倍体积无水乙醇 0.1体积NaAc 沉淀DNA 离心 70%