临床基因扩增检验操作规范教案.pptVIP

* ②加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可通过使用有滤筛的吸头避免污染 （将模板DNA加入PCR系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应，所有并非即用管都应盖严）。 * ③ 打开标本管盖引起样品飞溅 （打开前须瞬间离心） ④操作时手套引起的交叉污染 （拿过模板DNA管后应更换手套） * ⑤不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染 （必须设置一个不含模板DNA但含PCR系统中所有其他成分的对照反应。这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加）。 ⑥实验室污染 * 3. PCR检测结果不稳定 （1）样品处理方法不当，标本中杂质很多， 血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。 蛋白质——DNA电泳带拖尾 血红素中的卟啉化合物——抑制Taq酶活性 代谢产物——干扰引物配对 * （2）操作不当带来的后果 主要指不能严格按照说明进行操作造成PCR检测失败。 如HCV RNA PCR样品处理试剂A、B、C和75%乙醇的操作过程。 * 50μl血清标本 ( 标本可用血清或血浆，尽量避免使用肝素做抗凝剂， 避免反复冻融 ) ?加200μl试剂A后立即混匀 ( 试剂A是强烈的变性剂，不仅要将病毒外壳变性裂解，释放 核酸，而且要将样品中包含的其它蛋白（包括RNase）变性， 以避免蛋白进入PCR反应体系（RNase降解RNA模板），干 扰PCR扩增；混匀这一步至关重要，一定要振荡混合均匀才 能达到充分变性的结果。) 加入试剂B（氯仿、异戊醇）50μl混匀 （抽取变性剂及变性的蛋白，分离出核酸，同样必须充分 混匀，否则也会引起PCR检测失败 ) * 14 000r/min离心5min取上清80～100μl ( 取上清一定要小心，不能抽取中间蛋白沉淀层，否则 因核酸沉淀中含有变性蛋白，引起PCR检测失败 ) 加等体积试剂C14 000r/min离心10min，弃上清 (将核酸从水溶液中沉淀浓缩) ? 用75%乙醇洗一次 (除去与核酸共沉淀的盐及杂质) ? 干燥备用 (干燥后，切勿将管子倒置或掉落，防止沉淀飞出管底) * 在痰标本处理时液化是十分重要的，痰没有彻底液化，病原体不能完全释放出来；反之液化过度会使病原体裂解，导致PCR检测失败。 总之，样品处理对PCR检测是至关重要的，是导致PCR检测失败的最常见原因之一。 * * （六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增 有多种因素可引起核酸扩增检测假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg++浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。 扩增仪孔中热传导的均一性极为重要。 * RT-PCR操作注意： ①标本必须新鲜； ②做RNA标本的枪头离心管必须无菌； ③冰上操作； ④处理完后须立即上机，不能放置； ⑤注意左右手分开。 * （七）扩增产物的分析 扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。 * 实时荧光定量PCR 在荧光定量PCR基础上实时监测PCR全过程，最后通过曲线进行定量分析。 与一般荧光定量PCR使用荧光强度定量不同，实时荧光PCR一般使用Ct（每个反应荧光信号达到设定域值所经的循环数）定量，Ct与模板初始拷贝数的对数成线性关系。 实时荧光PCR的优点： 　精密度高，重复性能好。 * TaqMan荧光定量PCR原理 探针两端分别用荧光基团和淬灭基团标记，因为距离相近，基团相互作用，不产生荧光； 探针与模板杂交在引物区间内，当扩增进行时，Taq DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性降解探针，荧光基团和淬灭