[生物学]过程分子生物学第六章.ppt

基因的表达与调控 基因组与基因组学 GC岛探测法 人类基因转录单位的上游，存在着GC丰富区，这一区域的DNA片段可用那些识别序列中富含GC的内切酶消化，能切开的地方很有可 能是基因的上游邻近区。例如： Apa I（GGGCCC） Nar I （GGCGCC） Xma III（CGGCCG） Sma I （CCCGGG） Sst II （CCGCGG） BssH II（GCGCGC） 外显子扩增法 将克隆的DNA片段插入到某一基因的两个外显子之间，并接在哺乳动物载体上，转化动物细胞。从中分离纯化mRNA，逆转录成单链DNA，PCR扩增，电泳比较cDNA片段大小。若克隆的DNA片段含有外显子，则cDNA E1 E2 Intron 待测片段 重组 转录 剪切 反转录 DNA hnRNA mRNA cDNA 应比两个外显子更长。 cDNA杂交对比定位法 以生物体特定组织或细胞的cDNA芯片杂交克隆的基因组DNA片段，杂交阳性的DNA克隆序列即 为蛋白质编码基因。 6E 基因组结构的解析 b 确定基因的时空特异性表达谱 生物体 肝脏 大脑 血液 神经 心脏 红细胞 噬中粒 噬酸粒 噬碱粒 血小板 G0 期 G1 期 G2 期 S 期 M 期 基因组 定位 cDNA文库 6E 基因组结构的解析 c 确定基因的生物功能 模式生物 基因定点敲除 gene knock-out 基因定向导入 gene knock-in Loss-of-Function Gain-of-Function 酶切片段末端标记法 H H H H S S S S S S S S S S S S S S S S S S S 单一克隆指纹图谱 十克隆指纹图谱 载体DNA 克隆DNA 将若干克隆固定在薄膜上，并复制20份薄膜；合成20种不同序列的短探针，其序列是随机的；用20种探针随机定位杂交（一对一）20份克隆薄膜；如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将阳性记为“1”，而阴性记为“0”， 随机探针联合杂交法 这样便可将结果清晰地列成一张表，最终排出上述克隆的排列顺序。 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A B C D E F G 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 03 10 09 20 18 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 F C A D G E B 染色体走读排序法 从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列 分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库，阳性克 分别亚克隆，亚克隆片段在0.5 - 2.0 kb范围内。 然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至 隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起。 线型染色体DNA的端点。 走读的起点克隆片段 染色体走读排序法 走读的起点克隆片段 亚克隆旁测序列 探针标记 第一轮杂交 阳性克隆 阳性克隆 第二轮杂交 第二轮杂交 6C 基因组文库的构建 原核生物的基因文库大都采用l-DNA或Cosmid载体构建，但若用Cosmid构建人的基因组文库，工作量太大，几乎难以进行。目前已发展了用酵母人造染色体（YAC）或细菌人造染色体（BAC）克隆几百甚至上千kbDNA大片段的技术，这样可大大简化构建人基因组文库的工作量。例如，要求人基因组文库的完备性为99.999%，若用Cosmid（装载量为40kb）构建一条人染色体的基因组文库（平均长度为150Mb），则需要4.3×104个克隆；而用YAC载体构建则 仅需4.3×103个克隆，相当于将整条染色体DNA克隆10-15次。 6C 基因组文库的构建 a 用于大型基因组文库构建的克隆载体 开发装载量在100-1000kb范围内的克隆载体是基因组计划实施的 酵母人造染色体（YAC） 重要条件。目前已发展了多种用于克隆大型DNA片段的特殊载体： 细菌人造染色体（BAC） 噬菌体人造染色体（PAC） 可转化人工染色体（T