仪器分析第4章高效液相色谱分析.pptVIP

光电二极管阵列检测器（PDA或DAD） 第五节 高效毛细管电泳简介 2、电泳现象与电渗流现象 3、分离过程： 4、分离类型 二、仪器装置 三、主要特点和应用 第六节 纸层析和薄层层析法 三、特点及应用 三、离子交换色谱 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。 1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。 2. 固定相 按离子交换剂类型分四种： 微孔型 大孔型 微孔 微孔 薄膜型 表面多孔型 离子交换层 惰性核 惰性核 离子交换剂硅胶层涂覆 按固定相制作方法可分为： 多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型)； 表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂； 离子交换键合型。 3. 流动相 离子交换色谱流动相为无机酸或无机碱的盐类缓冲溶液（有一定pH和离子强度），通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。 四、离子色谱（IC） 以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象。 原理: 采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相； 在分离柱后，用另外一支抑制柱来消除淋洗液的高本底电流; 采用电导检测器检测流出组分。快速分离分析微量无机离子混合物; 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。 例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应： R+—OH + HCl(流动相)——R+—Cl- + H2O R+—OH + MCl(待测物) ——R+—Cl + M+OH- 可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。 特点： 分析速度快：可在数分钟内完成一个试样的分析； 分离能力高：在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离； 分离混合阴离子（NO3—、NO2－、SO42－、PO43－等）惟一快速、灵敏、准确的最有效分析方法 。 缺点：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。 五、离子对色谱法（IPC） 主要用来分离强极性有机酸和有机碱。 原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子与对离子形成疏水型离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。 阴离子分离的对离子：烷基铵类 阳离子分离的对离子：烷基磺酸类 六、尺寸排阻色谱法 又称凝胶（渗透）色谱，主要用于大分子的分子分离。它是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。 1、分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小（分子量大小）先后从柱中流出。 2. 固定相 3. 流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似（润湿凝胶）、粘度小（增加扩散速度）。 七、亲合色谱 主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行选择性分离及纯化的方法。 特点：选择性过滤、纯化效果好。 第四节 色谱分离方法的选择 一般可根据试样相对分子质量范围、溶解度及分子结构等进行分离方法的初步选择。 一、根据相对分子质量选择 二、根据溶解性选择 三、根据分子结构选择 一、基本原理 1、概述 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。 毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据试样中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离、分析物质的一类液相技术，是经典电泳和现代微柱分离的结合。 电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移（定向移动），速度ν电泳 电渗流现象：石英玻璃表面存在硅羟基，pH3时, 形成双电层，在高电场的作用下，双电层中的水合阳离子引起毛细管中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流 毛细管区带电泳（CZE）：最普遍、最基本的一种分离模式。 毛细管凝胶电泳（CGE）：将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够