[医学]第三章 蛋白质组与蛋白质组学3.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * DNA-蛋白质结合位点的检测 DNase I足迹分析 (DNase I footprint analysis) DNA分子上的特定序列与DNA结合蛋白结合后，后者可保护该部位的DNA序列不受DNaseI的攻击。 ? 基本原理 ? 基本步骤 ? 将待测双链DNA片段中的一条单链的一端用放射性核素标记； ? 加入待测蛋白质，使之与末端标记的DNA形成复合物； ? 加入适量的DNaseI进行部分消化，使DNA断裂为相差一个核苷酸的不同片段； ? 标本经变性后在测序聚丙烯酰胺凝胶中电泳，放射自显影，使之出现以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带。 也称作DNase I 保护实验，是体外鉴定DNA结合蛋白在DNA分子上的结合位点的实验方法。 DNase Ⅰ足纹分析是目前广泛用于蛋白质精确结合位点的研究方法。 原理：DNase Ⅰ可以随机水解核苷酸中的磷酸二酯键，将DNA切成单核苷酸，而结合有蛋白质的DNA免于DNaseⅠ的水解。 DNA-蛋白质结合位点的检测 DNA结合蛋白 有 无 DNA探针测序反应 DNaseⅠ足纹分析原理示意图 （五）核酸-蛋白质杂交实验 蛋白质杂交 SDSTBE缓冲液中DNA蛋白质杂交 缓慢复性、封闭、预杂交 加入同位素标记的DNA片段作探针 多次洗膜 放射自显影 用于鉴定蛋白质与DNA的特异性结合和确定集合蛋白质的分子量。 基本步骤： 蛋白质杂交 SDS转移至NC膜或Nylon膜 缓慢复性、封闭、预杂交 加入同位素标记的DNA片段作探针 多次洗膜 二、蛋白质-核酸 Southwestern 印迹 一种核酸-蛋白质杂交实验，能够快速鉴定蛋白质与DNA的结合并测算所结合蛋白的分子量。 ? 基本原理 待测的蛋白质样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后由电印迹转移至硝酸纤维素膜上，然后加入经放射性核素标记的特定DNA片断(探针)，在相应的缓冲液中进行DNA与蛋白质的杂交,洗膜后进行放射自显影。根据标记信号的有无，即可判断待测样品中是否存在与探针DNA结合的蛋白，以及结合蛋白质的分子量。 第四节 蛋白质数据库及其应用 二、蛋白质数据库的应用 　一、蛋白质数据库(Protein Database) 一、蛋白质数据库 （一）蛋白质序列数据库 （二）蛋白质结构数据库 （三）蛋白质直系同源簇数据库 （四）DIP数据库 一、蛋白质数据库 （一）蛋白质序列数据库 SWISS-PROT数据库： http://www.ebi.ac.uk/swissprot PIR和PSD数据库 / /pir 蛋白质数据仓库 /pdb/ 蛋白质结构分类数据库 http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/ PROSITE数据库 http://www.expasy.ch/proside/ （二）蛋白质结构数据库 一、蛋白质数据库 （三）蛋白质直系同源簇（COGs)数据库 /COG （四）DIP数据库(DIP Database) / 一、蛋白质数据库 二、蛋白质数据库的应用 （一）序列比较 序列两两对比 多序列对比 （二）临床诊断 （三）肿瘤治疗药物的开发 * * * * * * * * * * * * * 通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。 (三)图像分析技术 二、分析鉴定 2-DE图像分析软件包操作过程： 图像采集 斑点检测 背景消减 获得蛋白质相关信息 图像内及图像间的比较 二、分析鉴定 放射性核素标记亲和标签法 正常细胞 D0亲和标签 病理细胞 D8亲和标签 混合并消化 生物素亲和纯化 液相色谱－质谱联用分析 测量两个不同样品中蛋白质的相对丰度 二、分析鉴定 蛋白芯片(protein chip)技术 将一系列“诱饵”蛋白以阵列方式固定在经过特殊处理的底板上，然后将其与待分析的样品杂交，只有