第二章酶化学2011-5-4b2.ppt

别 构 酶 4、别构酶的V—[S]的动力学曲线 正协同效应 别构酶的V—[S]的动力学曲线 别构酶的V—[S]的动力学曲线 不加激活剂或抑制剂 ① 同位效应为正协同效应的别构酶是S型曲线 当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度。 米氏酶： [S]0.9/[S]0.1=81 别构酶（n=4）：[S]0.9/[S]0.1=3 表明表明反应速度对底物浓度的变化敏感，当底物浓度发生较小变化时，如上升3倍，别构酶的酶促反应速度可以从0.1Vmax升至0.9Vmax 。 ② 同位效应为负协同效应的别构酶是表观双曲线 表明反应速度对底物浓度的变化不敏感 别构酶的V—[S]的动力学曲线 加激活剂或抑制剂 ③ 调节物的别构效应(异位效应） ?? 当增加正调节物浓度时，Km 减小，亲和力增大，协同性减 小（对底物浓度的反应灵敏度 降低） 。 ?? 当增加负调节物的浓度时， Km增加，亲和力减小，协同性 增大（对底物浓度的反应灵敏 度增加 别 构 酶 5、别构酶的鉴定 ①?? 双倒数作图不是直线 ② 协同指数法（cooperativity index , Ci) 饱和比值（saturation ratio, Rs) 别构酶的鉴定 米氏酶：当反应速率为0.9Vmax时，[S]=9Km 当反应速率为0.1Vmax时，[S]=1/9Km Rs=81 正协同：Rs＜81，越小，正协同性越大 负协同：Rs＞81 ，越大，负协同性越大 别构酶的鉴定 米氏酶： Rs=81 正协同： Rs＜81 负协同： Rs＞81 ③??Hill系数法 米氏酶：n=1 正协同： n＞1 ，越大，正协同性越大 负协同： n＜1 ，越小，负协同性越大 ④ 脱敏作用： 理化处理后，仍保持活性，但失去调节性质。 脱敏后的别构酶表现为米式酶的动力学曲线 2、胰凝乳蛋白酶 胰凝乳蛋白酶典型的催化机制： 广义酸碱催化 共价催化。 活性中心由Ser195、His57、Asp102 组成； Ser195的活性中心确定：用DIFP（二异丙基氟磷酸）进行化学修饰。（有机磷杀虫剂） ?? His57的催化活性确定：用不可逆抑制剂TPCK（N-对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮）。 ??水解过程分酰化和脱酰两个阶段。 胰凝乳蛋白酶 3、胰凝乳蛋白酶的催化机制 丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser -His-Asp催化三联体 电荷中继网： 通过电荷中继网进行 没有底物时： Ser195—His57—Asp102形成一个氢键体系， His57是去质子化状态， Asp102的COO-通过氢键定位并固定His57。 结合底物时： His57从Ser195接受一个质子，增加了Ser195羟基氧原子对底物的亲核攻击性， Asp102的COO-稳定过度态中His57的正电荷形式。 Ser -His-Asp催化三联体 没有底物时 结合底物时 胰凝乳蛋白酶的活性中心 结合部位：决定专一性 丝氨酸蛋白酶的专一性 丝氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹陷的小口袋中，口袋的大小以及口袋内的微环境（疏水性、电荷性质）决定了丝氨酸蛋白酶的底物专一性 趋异进化 丝氨酸蛋白酶的专一性 胰凝乳蛋白酶 ：口袋较大，主要由疏水氨基酸残基围成，开口较大（由两个Gly组成），因此需要底物有一个疏水基团（芳香环Phe、Tyr、Trp及大的非极性侧链）定位。裂解芳香族氨基酸羧基侧的肽键 胰蛋白酶：口袋较大，底部有Asp，利于 Lys.、Arg结合，裂解碱性氨基酸残基羧基侧的肽键 弹性蛋白酶：口袋较浅，开口较小（由Val，Thr组成）只能让Ala等小分进入，裂解小的中性氨基酸残基羧基侧的肽键 结合中心 胰凝乳蛋白酶的催化机制 胰凝乳蛋白酶的活性中心 结合部位：决定专一性 胰凝乳蛋白酶的催化机制 Activation Of Ser residue covalent linkage with carbonyl group of polypeptide chain and Formation of tetrahedral inter-mediate transition state Cleavage of peptide bond 第1次四面体过渡态中间物 胰凝乳蛋白酶的催化机制 Activation of water molecule by pairing with its hydrogen atom (through a basi